水稻白条纹叶突变体wsl1的遗传分析及基因精细定位

从粳稻日本晴和籼稻R1128杂交衍生的重组自交系群体中获得一个稳定遗传的白条纹叶突变体wsl1(white stripe leaf 1),世代为F10。与亲本R1128相比,突变体wsl1表现出白条纹叶,同时叶脉呈现白化,该性状在苗期就出现并持续整个生育期;突变体的株高、每穗总粒数、剑叶长、生育期显著增加,而结实率显著下降,其他农艺性状没有显著变化。分蘖期突变体wsl1的叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素含量较杂交亲本R1128显著下降;透射电镜观察表明,与野生型相比,突变体的叶绿体形状异常,不规则。遗传分析表明,该突变性状由1对隐性核基因控制。精细定位后发现,目标基因WSL1位于第1染色体短臂上标记M1-54与标记M1-70之间,两者相距89.7kb。生物信息学分析表明候选区间内共有8个开放阅读框,暂未发现已报道的叶色相关基因;其中LOC_Os01g02080编码肽基脯氨酰顺反异构酶,GO(Gene Ontology)分类显示其可能与类囊体形成有关,后续将通过比较测序、qRT-PCR等分子实验来确定候选基因。     

水稻白条叶突变体(st10)的遗传分析与基因定位

在水稻甲基磺酸乙醇(Ethylmethane Sulphonate,EMS)诱变突变体库中,发现了一个以粳稻品种日本晴(Nipponbare)为背景的白条叶突变体,该突变体叶片在2-3叶期出现纵向白条的突变性状,此后随着植株的生长逐渐弱化,至抽穗期叶片颜色基本恢复正常,只有叶脉仍呈白色.白条性状受温度影响,高温时性状明...     

水稻半矮秆基因iga-1的鉴定及精细定位

在前期通过空间诱变获得半矮秆隐性突变基因iga-1的基础上,进一步对iga-1进行鉴定。农艺性状调查表明携带iga-1的矮秆株系CHA-2、CHA-2N与原种特籼占13相比存在明显变异。节间长度测量显示CHA-2、CHA-2N节间比例正常,属dn型。外源GA₃处理、内源GA₃测定和α-淀粉酶活性检测揭示iga-1与GA₃调控无关。利用CHA-2与粳稻品种02428杂交获得的F₂群体将iga-1定位在水稻第5染色体两个InDel标记DL18和DL19间32.01 kb的物理距离内。该区域有5个阅读框架,其中包括赤霉素信号传导调控基因D1。序列分析表明CHA-2、CHA-2N和特籼占13在D1位点上基因组序列不存在差异,推测D1并非iga-1的候选基因。比较水稻第5染色体上其他矮秆基因发现iga-1可能与半矮秆基因sd-7来自同一位点。     

水稻白条纹叶Gws基因的精细定位与遗传分析

叶色突变是一类十分明显的性状突变,在高等植物的叶绿素合成、叶绿体结构、功能、遗传、分化与发育等基础研究中均具有重要意义。到目前为止,已鉴定多个重要的水稻功能基因,据不完全统计,水稻中至少已定位了79个叶色突变位点,并已成功克隆出多个叶色相关基因,其中OsCHLH、OsCAO1、OsCAO2、chlorina1、chlorina9、ygl等直接参与编码叶绿素合成,其余基因均参与叶绿体发育调控。在日本晴(Nipponbare)T-DNA插入突变体库中筛选到一份对温度敏感的白条纹突变体gws(green-white-stripe),遗传分析表明它来自组织培养过程中的单隐性基因突变。利用gws与培矮64杂交组合的F2代群体,将Gws精细定位于第6染色体标记InDel15和InDel16之间,物理距离为73kb,此区间内包含13个基因。基因组序列分析发现,突变体在核糖核苷二磷酸还原酶小亚基(ribonucleoside-diphosphate reductase small chain,RNRS1)编码区第314～315碱基发生缺失,第316～317碱基由GC变为TT,导致该基因阅读框移码突变,蛋白质翻译提前终止。该基因是已经报道的水稻白条纹叶基因St1(Stripe1)的等位基因,gws突变体较st1突变体的白条纹出现早且明显,gws白条纹表型出现在第2片叶之后,而st1的白条纹表型仅出现在第4或5片叶之后。     

一个水稻显性斑点叶突变体的鉴定和基因精细定位

通过EMS (ethane methyl sulfonate)诱变籼稻品种IR64获得一个稳定遗传的显性斑点叶突变体HM113。在大田环境下,突变体褐色斑点在播种后3周的叶片上产生,始穗期扩散至叶鞘。与野生型IR64相比,突变体HM113的株高、结实率和千粒重等农艺性状显著下降,光合色素含量、净光合速率和可溶性蛋白含量显著降低。同时突变体CAT和SOD活性显著降低,POD活性显著上升。组织化学分析显示,突变体叶片中积累了大量活性氧,且斑点处细胞坏死。白叶枯病菌接种结果显示,HM113是一个广谱抗性增强的突变体。实时定量PCR分析表明HM113中防卫反应基因AOS2、PAL4、PR10和PR1b等的表达大幅上调。遗传分析表明,突变体褐斑性状受单显性基因(Spl^HM113)控制,利用图位克隆法将该基因定位在第7染色体长臂RM21605和RM418之间,物理距离约为308 kb。本研究为褐斑基因Spl^HM113的克隆与功能分析奠定了基础。     

水稻F1花粉不育基因的精细定位及其遗传分化研究

水稻籼粳亚种间杂种的不育性限制了亚种间的遗传交流和杂种优势利用。本研究通过发展位置特异性的微卫星标记将F1花粉不育基因S-6座位进行了精细定位；通过分析近等基因系中代换片段的遗传效应，鉴定出了F1花粉不育基因S-d座位，利用位置特异性的微卫星标记将S-d进行了定位；根据基因组的序列资料和利用较大的作图群体对S-6和S-d两个座位进行了物理作图；通过分子标记辅助选择培育了一批复等位基因近等基因系，对育性基因的遗传分化进行了研究。取得了如下主要结果：1、根据S-6座位初步定位的结果发展位置特异性的微卫星标记，将F1花粉不育基因座S-6进行了精细定位。结果表明多态性标记均与S-6座位紧密连锁，其中R830STS、PSM7、PSM8、PSM9、．PSM59和PSM60位于S-6座位一端，与S-6座位遗传距离分别为1．5cM、1．2cM、0．9cM、0．9cM、0．9cM和0．9cM，而PSM202、PSM206、PSM208、RMl3、R2213SSTS和RM413位于S-6座位的另一端，与S-6座位的遗传距离分别为0．9cM、2．1cM、3．8cM、4．1cM、4．4cM和5．3cM。2、根据S-6座位精细定位的结果，从IRGSP下载了S-6座位所在区域克隆的序列，将克隆的序列进行了拼接，同时将与S-6座位紧密连锁的分子标记与序列拼接图进行了电子整合。根据整合的结果发展位置特异性的微卫星标记和STS标记，利用500株的作图群体，最终将S-6座位界定在PSM8与PSM215之间182．2kb的范围，其中PSM214、T17、T18和T19与S-6座位完全连锁。3、通过对近等基因系E11-5中代换片段遗传效应的分析，在第1染色体的代换片段上鉴定出一个新的F1花粉不育基因座S-d。根据基因组的序列发展位置特异性的微卫星标记将S-d座位进行了定位。结果表明多态性标记均与S-d座位紧密连锁，其中PSM27、PSM24、．PSM26、PSM23、PSM31、PSM25、PSM37、PSM41、PSM42、PSM43、．PSM44、．PSMl2和PSMl3位于S-d座位的一端，与S-d座位的遗传距离分别为10．6cM、7．2cM、7．2cM、6．8cM、6．8cM、6．4cM、6．4cM、4．8cM、4．8cM、3．2cM、1．6cM、0．4cM和0．4cM，而RM84、RM86、RM323、RMl和RM283位于S-d座位的另一端，与S-d座位的遗传距离分别为3．8cM、4．6cM、6．7cM、7．5cM和8．7cM。4、根据S—d座位定位的结果，从IRGSP下载了S-d座位所在区域克隆的序列，将克隆的序列进行了拼接，同时将与S-d紧密连锁的分子标记与序列拼接图进行了电子整合。根据整合的结果发展位置特异性的微卫星标记和STS标记，利用2160株的作图群体，最终将S-d座位界定在67．8kb的范围内，其中PSM93和PSM74位于S-d座位的两侧且各与S-d仅有一个重组，而PSM95、PSM96、T1和T2与S-d座位完全连锁。RiceGAAS注释分析表明在此区段有17个ORF。，其中3个ORF可能与杂种不育性有关。BLAST分析表明此段序列籼粳之间的同源性较低，这也可能是杂种不育的一个原因。5、通过分子标记辅助选择，在F1花粉不育基因s-n、s-6、s-c和s-d座位各培育了一批复等位基因近等基因系，测交分析表明各不育基因座位上的不育基因不仅分化为相对的S^i和S^j，而且基因型类型相同的复等位基因的遗传分化也达到了显著差异的水平。携带有多个复等位基因的近等基因系的测交分析表明，复等位基因近等基因系的遗传效应为各基因座位遗传效应的累加，各基因的遗传效应相互独立，彼此间无相互作用。     

水稻抗稻瘟病基因Pi47的精细定位和候选基因分析

不断挖掘和克隆抗稻瘟病新基因, 是解析水稻抗病分子遗传机制和培育抗稻瘟病新品种的重要基础。Pi47是笔者从广谱、持久抗稻瘟病湖南地方品种湘资3150中鉴定的稻瘟病抗性基因, 前期研究将其初步定位于第11染色体标记RM224和RM5926间。本研究利用3个Pi47单基因系与感病亲本CO39杂交F₂群体1687个感病单株对Pi47精细定位, 利用6个STS标记对3个单基因系进行背景分析, 采用生物信息学方法进行了候选基因分析。结果表明, Pi47被精细定位于CAPS标记S32与K33间0.24 cM区域的171.2 kb物理区间内, 背景分析将Pi47进一步缩小至SC12和K33间67.8 kb的区间内; 该区间含有8个结构基因, 其中2个编码NBS-LRR抗病类似蛋白, 为Pi47的候选功能基因。稻瘟菌抗谱比较分析发现, Pi47单基因系与其定位区间内4个Pik位点的等位基因Pik、Pikm、Pikh和Pikp的近等基因系抗谱不同。这些结果为进一步克隆Pi47和利用其进行分子标记辅助选择培育抗稻瘟病水稻新品种奠定了基础。     

水稻ygl80黄绿叶突变体的遗传分析与目标基因精细定位

通过化学诱变获得遗传稳定的水稻黄绿叶突变体ygl80。与野生型亲本10079相比,ygl80突变体在苗期和孕穗期叶片叶绿素分别下降76.64%和54.59%,类胡萝卜素含量分别下降53.85%和41.18%,成熟期株高、每株有效穗数、每穗着粒数、穗长和千粒重分别减少14.8%、16.5%、21.3%、9.1%和7.4%。遗传分析表明,ygl80的突变性状由1对隐性核基因控制。利用(ygl80/浙辐802) F₂作为定位群体, 将突变基因定位在第5染色体长臂InDel标记C2和C3之间,遗传距离分别为0.24 cM 和0.39 cM,两标记之间的物理距离约为90 kb,此区间内包含11个预测基因。基因组序列分析发现,ygl80突变体在编码叶绿素合酶的YGL1(LOC_Os05g28200)基因编码区第5027碱基处(位于第14外显子),碱基C突变为碱基T,使编码蛋白序列第348位的脯氨酸(Pro)突变成亮氨酸(Leu)。该基因是已报道的水稻ygl1黄绿叶突变基因的等位基因。ygl80突变体在整个生育期都表现为黄绿叶,而ygl1突变体在苗期叶片黄化,中期慢慢转绿,后期叶色以及总叶绿素和类胡萝卜素的含量接近野生型,这可能是YGL1基因编码的叶绿素合酶蛋白的氨基酸不同突变位点造成的。     

水稻斑马叶突变体zebra1349的表型鉴定及基因精细定位

从恢复系育种材料[R128//(R318/R1025)F1]F6中获得一个新的斑马叶突变体zebra1349,突变体秧苗期如果不移栽,与野生型一样表现绿色,移栽后5 d新抽出的叶片包括叶鞘会呈现出与叶脉垂直的黄绿相间的条纹,移栽后30 d抽出的叶片又表现正常绿色,成熟期主要农艺性状与野生型无明显差异。与野生型相比,突变体六叶期斑马叶黄区部位的总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量分别下降了55.86%、61.02%、39.34%和47.03%。透射电镜(TEM)观察表明,突变体斑马叶绿区部位叶绿体发育正常;黄区部位叶肉细胞中叶绿体结构异常,类囊体膜退化和分解严重,类囊体基粒片层数量明显减少,片层间距拉大,排列疏松。对zebra1349与正常叶色品种杂交F1、F2代的遗传分析表明该性状受1对隐性核基因调控。利用1192株zebra1349/02428 F2隐性定位群体,最终把ZEBRA1349基因定位在水稻第12染色体In Del标记indel39和indel44之间,其遗传距离分别为0.04 c M和0.17 c M,根据日本晴基因组序列推测,两标记之间的物理距离约为89 kb。本研究为ZEBRA1349基因的图位克隆和功能研究以及分子标记辅助育种奠定了基础。     

一个水稻黄绿叶突变基因的定位和遗传研究

从粳稻品种日本晴经⁶⁰Co诱变的M₁材料中发现一个黄绿叶突变体, 其叶片从萌发到三叶前期表现白化, 三叶后期开始转为黄绿叶, 直到衰老。遗传分析表明, 该突变表型受一对隐性核基因控制, 将该黄绿叶突变体暂定名为ygl8951。与野生型相比, ygl8951的叶绿素含量与类胡萝卜素含量显著降低。电子显微镜观察表明ygl8951内叶绿体数量明显减少, 叶绿体内没有基粒类囊体, 只有类似间质类囊体结构。基因表达定量分析表明, 突变体中光系统I和光系统II基因表达水平明显下调, 核糖体结构基因和质体编码的RNA聚合酶亚基基因表达明显上调。利用ygl8951与籼稻品种黄华占杂交获得的F₂分离群体, 将该基因定位于水稻第6染色体上的In/Del标记607489与607611之间, 物理距离191 kb的范围内, 通过分析确认该基因为一个新的调控叶色的基因。     

水稻中脉缺陷突变体dl-6的遗传分析与精细定位

为了克隆DL-6基因,以dl-6与9311配制正反杂交组合进行性状分析发现,dl-6突变性状受1对隐性核基因控制,利用SSR分子标记将控制dl-6性状的基因DL-6初步定位在水稻第3染色体的短臂上,进一步利用新发展的InDel标记将DL-6基因精细定位在I3-5和I3-8之间85 kb的物理距离内。对该区段内存在的开放阅读框( ORF)进行分析,发现其中ORF9编码的YABBY基因是一个与叶脉发育相关的基因,对突变体dl-6和野生型中YABBY基因进行测序,将测序结果与数据中日本晴序列进行比对发现,突变体dl-6中YABBY基因的第1个外显子存在1个单碱基突变,该突变导致野生型中编码的半胱氨酸突变为突变体中的精氨酸;同时突变体dl-6在YABBY基因的3′端还存在8个碱基的缺失。这2个突变位点哪个是导致dl-6突变的功能区目前还不确定,有待进一步研究。     

水稻两用核不育系龙S抗稻瘟病主效基因的定位

龙S是一个广谱抗稻瘟病的水稻两用核不育系,利用分子标记技术精细定位其主效抗性基因,对于培育抗稻瘟病水稻新品种具有重要意义。采用来自国内外的41个稻瘟病菌系通过接种鉴定方式对龙S进行了稻瘟病抗谱分析,结果显示龙S的抗性频率为100%,对其中39个菌系表现高水平抗性,与Pi9的携带品种75-1-127抗性频率和抗病级别基本相当。群体遗传分析表明龙S的抗性基因表现为显性遗传方式,对于不同菌系龙S表现出不同的抗病遗传模式,其中龙S对稻瘟菌系318-2的抗性由单基因控制。通过抗病亲本龙S与感病亲本日本晴构建F₂分离群体,采用BSA (bulk segregant analysis)及RCA (recessive class analysis)分析方法,将龙S的主效抗病基因精细定位于第9染色体上的SSR标记M1-M2所在的1.31 cM区间,与已克隆的广谱抗稻瘟病基因Pi5位于相邻的染色体区域。抗谱分析表明,龙S与Pi5、Pii单基因系的抗性频率差异明显,抗谱较后二者更广。龙S主效抗性基因的精细定位,为进一步揭示其与Pi5、Pii的等位关系以及通过分子标记辅助选择培育抗病水稻新品种奠定了基础。     

水稻白穗突变体wp4的鉴定与基因精细定位

水稻开花灌浆期,内外颖呈绿色,含光合色素,为阐释非叶片组织叶绿体发育的分子机制,本文对EMS诱变获得的新型白穗突变体wp4进行了研究。抽穗灌浆期,wp4的穗轴呈绿色,内外颖呈乳白色;内外颖叶绿体发育不健全,无类囊体结构,叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量极显著降低。此外,wp4全生育期叶片呈淡黄色,叶绿体内基质片层较少且排列松散;与野生型相比,wp4的叶绿素a含量显著降低,叶绿素b和类胡萝卜素含量虽略低,但差异未达到显著水平。农艺性状分析发现,与野生型相比,wp4的有效穗和结实率略有增加,其他性状则略有降低,但变化均未达到显著差异水平。遗传分析表明wp4受一对隐性核基因调控,利用1200株西农1A/wp4的F2隐性群体,最终将WP4精细定位在第8染色体约79 kb的物理范围内,根据水稻基因组注释计划,该区间包含14个基因,这为WP4的功能和作用机制研究奠定了基础,也为水稻标记性状育种提供了新的资源。     

水稻叶片早衰及盐敏感突变体osles的生理分析和基因精细定位

突变体osles (Oryza sativa leaf early-senescence and salt-sensitive)是利用⁶⁰Co辐射诱变籼稻品种自选1号后筛选获得的,该突变体从分蘖期开始叶片就出现早衰,主要表现为叶尖和叶边缘变黄,伴有红褐色斑点。此外,盐胁迫下,不仅突变体叶片卷曲枯萎,而且植株高度和生物量显著降低。与野生型相比,突变体除倒一叶外,倒二叶和倒三叶在分蘖期的叶绿素含量均显著降低,而POD活性则在倒一叶、倒二叶和倒三叶中依次显著升高;突变体3片叶片的MDA含量均高于野生型15%左右。除倒一叶外,突变体的SOD活性均显著高于野生型。此外,突变体和野生型3片叶中的可溶性蛋白含量依次下降,但突变体的倒一和倒二叶中的可溶性蛋白含量显著高于野生型,而倒三叶则相反;遗传分析表明,osles突变性状受一隐性基因控制,借助图位克隆技术将控制该性状的基因精细定位于第6染色体长臂的IN6-005769-11/12和RM20547两个标记之间,物理距离为210 kb,为进一步克隆该基因并揭示叶片的早衰分子生理机制奠定基础。     

水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a的精细定位

分别以高抗细菌性条斑病的品种Acc8558和高感的品种H359为供体和受体亲本, 通过回交和分子标记辅助选择, 育成了只渗入5号染色体短臂上单个供体亲本细条病抗性QTL(qBlsr5a)的近等基因系H359-BLSR5a。将该近等基因系与H359杂交, 建立了一个大的F₂群体。采用选择极端表型个体并验证其后代(F_2:3)株系的方法, 在F₂群体中鉴定出目标QTL为抗病纯合基因型的个体。通过对这些个体进行分子标记基因型检测和连锁分析, 将qBlsr5a定位在SSR标记RM153和RM159之间, 大约2.4 cM或290 kb的范围内。     

水稻淡黄叶矮化突变体yld的遗传分析及基因定位

水稻叶色突变体是研究植物光合作用、叶绿素代谢和叶绿体发育的重要材料。本研究从籼稻品种蜀恢527经EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理后代中筛选出一个淡黄叶矮化突变体Yellow leaf and dwarf(yld)。与野生型蜀恢527相比,该突变体全生育期都表现出淡黄叶矮化性状,其剑叶的淡黄色表型最为明显,倒二叶次之,倒三叶最弱,其中剑叶的叶绿素及类胡萝卜素含量降低最为明显;并且伴随着穗粒数、千粒重、结实率、株高等主要农艺性状的显著降低,但有效穗显著增多。透射电镜观察结果显示,与野生型相比,该突变体多数叶绿体结构基本完整,但基粒模糊,基质片层大量减少且排列疏松。遗传分析表明,该突变性状受一对隐性核基因控制。在yld突变体与粳稻武运粳7号杂交的F2群体中分离出323个突变单株,最终将YLD基因定位在第11染色体的L5和L7两标记之间,物理距离为115.7 kb。本研究为YLD基因的克隆和功能分析奠定了基础。     

水稻向地性突变体的鉴定与遗传和定位分析

从水稻籼稻品种E优428的诱变M1代群体中获得向地性突变体la(t),该突变体在苗期倒伏生长,成熟期呈匍匐型生长,其它性状未发现异常。初步的生理研究表明该突变体不受外源激素(2,4-D,赤酶素)和光照的影响,并失去了感受重力的能力。遗传分析表明,该突变属单基因隐性突变,将该基因暂定名为la(t)。利用该突变体与籼稻品种D62B杂交,构建了F2代分离群体,用微卫星标记分析,将该基因定位于水稻第11染色体上的微卫星标记Lu2和Lu18之间,与目的基因分别相距1.0和1.7 cM。通过电子杂交的方法将该基因所在区域的遗传图谱整合到国际水稻基因组计划的水稻第11染色体物理图谱中,其la(t)基因两端毗连的Lu2和Lu18 SSR标记之间的物理距离约为140~200 kb。为用图位克隆法分离此目的基因和研究水稻向地性生长的分子机理奠定基础。