葡萄4 种病毒多重RT-PCR 检测体系的建立

 以复合感染4种病毒的‘红地球’（Red Globe）葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）、葡萄病毒B（Grapevine virus B,GVB）和葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196 bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。     

沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测

为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%～98.11%。     

沙地葡萄茎痘伴随病毒双重巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的沙地葡萄茎痘伴随病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV）全基因组序列设计了2组巢式RT-PCR检测引物repF1/R1→repF2/R2和cp F1/R1→cpF2/R2，扩增片段分别为902 bp和438 bp。通过对第1轮PCR扩增中引物组合repF1/R1-cpF1/R1、dNTPs、Taq DNA聚合酶和c DNA用量的优化，以及第2轮PCR扩增中引物组合repF2/R2-cpF2/R2、dNTPs和Taq DNA聚合酶用量的优化，建立了GRSPaV双重巢式RT-PCR检测方法。采用该方法对109份葡萄样品进行检测，结果显示，2对普通PCR引物RSP 52/53和RSP 9F/9R的合计检出率为65.1%,2组单一巢式PCR引物repF1/R1→repF2/R2和cp F1/R1→cpF2/R2的检出率总和为93.6%，而双重巢式PCR引物组合repF1/R1-cpF1/R1→repF2/R2-cpF2/R2的检出率也达到93.6%。该技术在保证检测效率的基础上降低了检测...     

酿酒葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物,在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53.0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0℃,采用单一RT-PCR技术检测酿酒葡萄6种常见的葡萄病毒,即葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)、葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)、葡萄卷叶病毒1(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-1)、葡萄卷叶病毒2(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-2)和葡萄卷叶病毒4(Grapevine leafroll associated virus-4,GLRa V-4)。在此基础上,对退火温度相似、扩增片段长度不同的引物进行组合,建立能同时检测2种或2种以上病毒的多重RT-PCR检测体系。【结果】单一RT-PCR结果显示,退火温度为49℃、55℃和60℃时,可分别检测GVA和GLRa V、GLRa V和GFKV以及GFLV和GLRa V。多重RT-PCR结果显示,退火温度分别为49℃和55℃时,引物GVA和GLRa V-2以及引物GLRa V-1和GFKV组合所建立的2个多重RT-PCR检测体系可同时检测葡萄叶片中GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV。所检测的河西地区16份样品普遍携带葡萄病毒,部分葡萄样品同时携带两种病毒。其中,5份样品为GVA阳性,8份为GLRa V-1阳性,3份为GLRa V-2阳性,5份为GFKV阳性,所有样品均未检测到GFLV和GLRa V-4。退火温度分别为49℃和55℃时所建立的GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV两个多重PCR扩增体系检测结果与各样品单一PCR检测结果均一致。【结论】建立2套多重PCR检测体系,可同时有效地检测GVA和GLRa V-2或GLRa V-1和GFKV,可用于田间葡萄样品的快速检测。     

山东省葡萄几种主要病毒病调查及检测研究

对采自山东省不同葡萄园类别的葡萄样品,采用PTA-ELISA法和Dot-ELISA法对葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)进行了检测,采用DAS-ELISA法对葡萄卷叶病的3个毒原(GL-RaV-1-、2-、3)进行了检测。GRSPaV检测结果表明:检测的61个品种518个样品,阳性样品率33.6%,阳性品种率73.8%,其中资源圃样品阳性率32.7%,生产园样品阳性率34.0%。对检测到阳性样品辅以RT-PCR法验证,2对引物均扩增出了预期片段,分别为解旋酶基因340 bp片段、CP基因842 bp片段。GLRaV-1-、2-、3的检测结果表明:鲜食品种3种病原的阳性样品率分别为33.7%、7.1%、62.2%,酿酒品种阳性样品率分别为35.1%、16.2%、54.1%,综合3种病毒的阳性样品率为76.3%,品种感染率87.7%。通过该类研究对推动国内葡萄无毒化生产有重要意义。     

胶东半岛地区葡萄病毒病田间调查和血清检测

2008年8—9月对胶东半岛葡萄主产区15个葡萄园的病毒病发生及危害情况进行了田间调查,采集了4个酿酒葡萄品种共计44份葡萄样品,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行病毒血清学检测。从样品中分别检出葡萄斑点病毒(GFKV)、葡萄卷叶病毒1(GLRaV-1)和葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3),检出率分别为6.82%、2.27%和40.91%。蛇龙珠样品中3种病毒均被检出,总检出率达60.71%;赤霞珠样品中检出了葡萄卷叶病毒3和葡萄斑点病毒,总检出率为36.46%。蓬莱地区葡萄样品中3种病毒均被检出,检出率达55.56%,龙口地区病毒检出率也达到了52.17%。     

中国葡萄卷叶相关病毒7检测及基因变异分析

葡萄卷叶相关病毒7(grapevine leafroll-associated virus 7,GLRaV-7)是与葡萄卷叶病相关的重要病原物之一。为明确中国GLRaV-7分离物的基因序列变异,采用RT-PCR方法对采自中国15个省(市)、自治区的188份葡萄样品进行检测,检出率为24.5%(44/188)。对来源于42个GLRaV-7分离物的外壳蛋白(coat protein,CP)和15个分离物的热休克蛋白70(heat-shock protein 70,HSP70)基因进行克隆、测序。序列分析结果显示,来源于国内外GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.12%~100.00%和88.94%~100.00%、85.33%~100.00%和88.97%~100.00%。基于CP和HSP70基因序列构建的进化树,分别将GLRaV-7分离物划分为6个和5个明显区分的组群。Gp3、Gp4和Gp5仅由中国分离物组成。本研究中初次分析国内外GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因序列变异,可为进一步开展GLRaV-7分子检测的研发及不同变种的致病性研究提供依据。     

基于RT-PCR检测对6个香味葡萄品种感染病毒状况的分析

为明确我国6个香味葡萄品种感染病毒的状况,2018—2019年采用RT-PCR方法,对来源于13个省(市、自治区)的212个样品进行了14种葡萄病毒的检测。结果显示:‘阳光玫瑰’‘玫瑰香’‘巨峰’‘夏黑’‘水晶葡萄’‘着色香’的带毒株率分别为93.22%、67.74%、82.98%、63.33%、27.27%、43.48%;以上各品种检出的病毒种类数分别为13、10、10、8、3、3种,其中分布较广的为沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)、葡萄斑点病毒(GFkV)和葡萄卷叶相关病毒3(GLRaV-3)。     

两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法,【方法】以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的成龄苹果树韧皮部为试材,根据基因库中苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)的外壳蛋白基因序列,设计合成了2对特异性引物,分别与合成的苹果茎沟病毒(ASGV)引物和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的引物组合配伍,筛选出最佳的引物对组合。对cDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化,对PCR过程中cDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明,反转录引物为Oligo(dT)18、总RNA 0.1～3.0μL时,可以得到较好的cDNA;ASPV-FR与ASGV-Pch、ACLSV-Pch引物组合优于ASPV-Pch,并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合;cDNA用量为2.0~4.0μL、退火温度为50.0~52.9℃、循环数为35时,扩增效果较好。采用优化的多重RT-PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测,并用3种病毒的单重RT-PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性,充分印证了该多重RT-PCR体系的准确性,适用于大量样品的快速检测。     

山东省沙地葡萄茎痘相关病毒的检测

为明确沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)在山东省发生的情况,2006-2007年在葡萄主栽区和葡萄品种资源圃进行了田间调查、样品采集和病原检测。应用GRSPaV外壳蛋白基因表达获得的多克隆抗体,经间接酶联免疫吸附试验(PTA-ELISA)和斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)检测,在2a采集的298个样品中,125个样品为阳性反应,阳性率41.95%。125个阳性样品涉及43个品种,品种被侵染率74.14%。研究对检测的样品用RT-PCR法验证,有3对引物均扩增出了预期片段,分别为解旋酶基因340bp片段、外壳蛋白(CP)基因842bp片段和RNA聚合酶(RdRp)基因499bp片段。     

叶面喷施褪黑素对干旱胁迫下苹果抗旱生理生化指标的影响

为探讨褪黑素对干旱胁迫下苹果生理生化指标的影响,以盆栽山定子砧1年生"红富士"苹果为试材,用不同浓度(50、100和200 mg/kg)褪黑素分别进行叶面喷施(连续喷3次,间隔期7 d)处理(以清水为对照)后,测定了控水(干旱胁迫)下各处理叶片水势、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等3种抗性相关酶活性的变化。结果表明,随着干旱胁迫程度(控水时间)增加,叶片水势下降,MDA含量、Pro含量、SOD活性、POD活性和CAT活性呈上升趋势,复水后则基本恢复。喷施褪黑素能缓解叶片水势的下降,能降低叶片MDA含量,能进一步提高Pro含量、SOD活性、POD活性和CAT活性,且100和200 mg/kg处理的效果好于50 mg/kg处理,但100和200 mg/kg处理之间没有明显差异。叶面喷施褪黑素可以缓解干旱对苹果幼苗的影响,提高苹果幼苗的抗旱性。综合抗旱效果和经济因素,推荐褪黑素使用浓度为100 mg/kg。     

甜樱桃设施栽培环境要求及调控技术

甜樱桃设施栽培具有使果实提早成熟、防止霜冻与裂果、调节果实供应期等优点,设施内的环境调控对甜樱桃设施栽培的产量和品质具有至关重要的作用。文章根据设施条件下甜樱桃的生长发育规律,分析总结了树体在萌芽期、花期及果实发育期对温度、湿度、光照、CO-----_2等环境因子的需求及调控技术措施,以期为甜樱桃设施栽培环境调控提供借鉴。     

缩短童期的措施对红茄梨实生苗根、叶中激素的影响

对红茄梨2年生实生苗实施拉枝、主干2次倒贴皮、植株喷300倍PBO液3个处理,研究不同措施对根和叶中的植物激素含量的影响。结果表明,拉枝使根、叶中的生长素、脱落酸含量均显著下降,赤霉素、细胞分裂素含量均显著上升;倒贴皮使根、叶中的生长素、赤霉素、细胞分裂素和脱落酸含量均明显下降;喷300倍PBO液使根、叶中生长素、赤霉素含量均明显下降,细胞分裂素、脱落酸含量均明显上升。根中的各种植物激素含量都低于叶中的含量。根、叶中的生长素、赤霉素和细胞分裂素之和与脱落酸的比值大小均为拉枝>对照>倒贴皮>喷300倍PBO液,由此可知拉枝会促进叶与根的生长,倒贴皮和喷300倍PBO腋都会限制根与叶的生长。     

柠檬成熟果实可溶性糖和有机酸积累特征分析

利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对贵州惠水栽培的3个柠檬品种(尤力克柠檬、四季柠檬、阿特摩柠檬)和2个地方特色宽皮柑桔品种(牛肉红朱桔和朱红桔)成熟果实(取果肉)的可溶性糖和有机酸进行了检测。结果表明,共检测到蔗糖、果糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、木糖醇、半乳糖苷、吡喃葡萄糖苷、麦芽糖和核糖等10种可溶性糖,以及柠檬酸、苹果酸、奎宁酸、草酸、棕榈酸、酒石酸、硬脂酸、2-酮戊二酸、甘油酸和D-葡萄糖酸等10种有机酸。柠檬和宽皮柑桔果肉中可溶性糖和有机酸的组分类似,差异主要在含量上,宽皮柑桔可溶性糖含量远高于柠檬,柠檬有机酸含量远高于宽皮柑桔。果肉中主要的可溶性糖为蔗糖、果糖和葡萄糖,这3种主要可溶性糖在宽皮柑桔中的平均含量(以干重计)为467.35、234.34和170.16 mg/g,均明显高于柠檬,分别是柠檬的4.51、2.18和1.68倍。柠檬酸是柑桔果肉中最主要的有机酸,柠檬果肉中柠檬酸平均含量为399.78 mg/g,是宽皮柑桔的12.18倍。可溶性糖和有机酸含量反映了柑桔品种的种质特征,与果实风味和口感一致。     

碱胁迫下两种苹果砧木幼苗根系生长和脱落酸含量的差异

为了分析苹果砧木根系对碱胁迫的响应,先对两种耐碱性不同的苹果砧木(高耐碱的富平楸子Malus prunifolia,中等耐碱的平邑甜茶M.hupehensis)幼苗根系结构和脱落酸(ABA)含量在碱胁迫下的变化进行了测定,再取碱胁迫不同时间的根尖进行转录组分析及ABA相关基因CIPK1和AHK1的qRT-PCR分析。结果表明,碱胁迫15 d,两种砧木幼苗根系生长均受到抑制,其中平邑甜茶的根系生长受到的抑制更明显。两种砧木幼苗根尖脱落酸(ABA)含量均在碱胁迫48 h有显著增加,但平邑甜茶的增幅较小。富平楸子幼苗根尖CIPK1和AHK1表达量在碱胁迫24 h和48 h均明显上调;平邑甜茶幼苗根尖的AHK1表达量在碱胁迫6和48 h略有上调,CIPK1表达量在碱胁迫48 h明显下调。     

基于COI基因对两种粉蚧遗传差异的研究

以柑桔臀纹粉蚧Planococcus citri和大洋臀纹粉蚧Planococcus minor为材料,提取粉蚧基因组DNA,通过COI基因作为分子标记,初步分析了它们的遗传差异和遗传进化关系。结果表明,获得两种粉蚧线粒体COI基因序列各9条,经校对编辑后序列长度为591 bp。其中T、C、A、G碱基平均含量分别为48.3%、10.3%、36.3%和5.1%。18条COI序列共定义4个单倍型,其中检测到变异位点15个,包含单一突变位点1个、简约信息位点14个。两种粉蚧的单倍型比例均为22.2%;Kimura 2-parameter遗传距离显示,种间遗传距离范围为0.001~0.024,平均遗传距离0.012。NJ进化树及ML进化树分析,两种粉蚧各自聚为1个支系。碱基替换饱和性分析显示,两种粉蚧碱基替换成线性关系,未达到饱和状态;经Tajima’s D检验,大洋臀纹粉蚧种群内存在高频稀有等位基因,而柑桔臀纹粉蚧低频稀有等位基因占主导。说明两种粉蚧的系统发育趋于保守,从长远看两种粉蚧形态特征有较大的的区别需要较长时间的发育进化。     

4个苹果品种果实品质的分析研究

对4个苹果品种富士、国光、金冠、红星的外观品种及营养成分进行比较分析,测定了其单果重、果形指数、硬度、糖酸含量、酚类物质含量等指标。结果表明,国光的酚类物质中绿原酸含量最高,酸度较高;红星的总多酚含量和原花青素含量最高,甜度高;富士和金冠的酚类物质含量较低。     

60Co-γ射线与ARTP复合诱变选育蛹虫草高产菌株

以实验室保存的蛹虫草菌株("BY2")为出发菌株,采用^60Co-γ射线与ARTP复合诱变方法对其进行处理,经过初筛、复筛及稳定性试验,研究了诱变菌株的菌落特征及子实体产量,以期获得蛹虫草高产菌种。结果表明:经复合诱变处理,筛选出3株高产突变株,其子实体产量与出发菌株相比提高率分别为32.27%、36.00%和33.87%。通过突变菌株的遗传稳定性及工厂化生产测试,BY2-1122菌株是传代稳定性较好的菌株,其子实体产量明显高于现行生产菌株,增幅达17.3%。研究表明,利用^60Co-γ射线与ARTP复合诱变选育蛹虫草,可以获得高产子实体菌株。     

GC-MS分析荷花的挥发油化学成分

为了分析荷花中挥发油的化学成分,采用水蒸气蒸馏法从新鲜荷花中提取挥发油,用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对挥发油的化学成分进行分离分析,并应用峰面积归一化法测定各成分的含量。试验共分离出95个峰,鉴定出80种化合物,其中主要成分为乙酸乙酯(6.61%)、1,4-二甲氧基苯(9.06%)、肉桂醛(6.60%)、肉桂醇(10.20%)、茉莉酮(4.75%)等挥发性的醇类、脂类、醛类、酸类和烯类化合物。通过试验可知,GC-MS能很好地鉴定出荷花挥发油的化合物组成,为荷花资源的开发利用奠定基础。     

采前高浓度赤霉素处理对“贵妃”杧果实色泽发育的抑制效应

以10年生"贵妃"杧植株为材料,设置赤霉素(GA_3)0、0.5、1.0、2.0和3.0 g/L等处理,分别于盛花期、幼果期和果实膨大期进行喷洒,比较不同处理对采后杧果果实色泽变化的影响。结果表明,与对照相比,不同浓度GA_3处理对果皮色度a~*值均具有明显影响,浓度越高,抑制a~*值增大的效果越显著;GA_3处理可以显著抑制果皮叶绿素的降解,降低类胡萝卜素及花青素的合成;高浓度GA_3对叶绿素酶、查尔酮异构酶活性增加、5-氨基乙酰脱氢酶活性的降低具有明显的抑制效果。说明采前GA_3处理可以抑制采后"贵妃"杧果皮色泽转变,浓度越高对果皮转色的抑制效果越显著。