过表达海马齿SpSOS1基因能增强转基因拟南芥的耐盐性

细胞膜Na~+/H~+逆转运蛋白SOS1在植物耐盐过程中起重要作用。本研究将盐生植物海马齿中的细胞膜Na~+/H~+逆转运蛋白基因SpSOS1构建到植物双元表达载体pCAMBIA1304上,采用农杆菌介导的方法将SpSOS1基因转入到拟南芥中,在含有50μg/mL潮霉素B的MS培养基上筛选转基因后代,结合目标基因和标记基因的PCR验证,获得了超表达的转基因拟南芥。利用T_3代转基因幼苗进行耐盐性分析。研究表明,转SpSOS1基因的拟南芥在50 mmol/L NaCl的培养基中发芽率在80%以上,明显高于野生型拟南芥的45%。转SpSOS1基因拟南芥幼苗的耐盐性明显提高,在100 mmol/L NaCl条件下能正常生长,具有较高的生物量、根长和侧根数,而野生型拟南芥在50 mmol/L NaCl的胁迫下明显萎蔫、失绿、甚至死亡。说明过表达SpSOS1基因显著提高了拟南芥的耐盐性。     

碱茅Put-HVA1基因的克隆及在酵母和拟南芥中的表达

本研究从碱茅(Puccinellia tenuiflora)cDNA文库中分离得到Put-HVA1基因,其开放读码框(ORF)长534bp,共编码177个氨基酸,其预测分子量约为18.167kD,理论等电点约为7.80。氨基酸序列比较结果表明,Put-HVA1氨基酸序列与水稻、玉米的HVA1蛋白氨基酸序列的同源性分别为69%和56%。另外,将Put-HVA1基因构建到酵母表达载体pYES2和植物双元表达载体pBI121上,并分别转化至酵母(INVSc1)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。对pYES2-Put-HVA1转化酵母进行盐碱、氧化胁迫、渗透胁迫及干旱处理,结果表明:重组酵母提高了对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力。对部分转基因株系进行了抗盐性试验,表明转Put-HVA1基因拟南芥在150mmol/L NaCl和5mmol/L NaHCO3胁迫下长势优于野生型拟南芥,表现出一定的耐受性。     

施氏假单胞菌Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA的克隆与表达分析

Na+/H+逆向转运蛋白是生物耐盐的关键因子,能够维持高盐胁迫下生物体的正常生长代谢。利 用PCR技术从施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）中克隆质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA。序列分 析表明,该基因全长1167 bp,编码388 个氨基酸,含有12 个跨膜结构域和保守的功能氨基酸残基位点： Asp-133、Asp-163、Asp-164、His-225、Gly-338。与大肠杆菌nhaA 基因核苷酸和编码氨基酸序列的同源 性分别为99%和99.2%。将该基因与pET-28a 构建成原核表达载体pET-nhaA,转化E.coli BL21,经IPTG 诱导后获得相对分子量约为41 kD的蛋白。平板法和生长曲线法检测表明,重组菌在800 mmol/L NaCl 胁迫下仍能正常生长,耐盐能力显著提高。以上结果证实克隆到的基因是施氏假单胞菌nhaA 基因家族 的成员,具有盐胁迫下将Na+逆向转运至胞外的功能,为进一步利用该基因进行作物耐盐改良奠定了基 础。该基因的GenBank登录号为EU545468。     

苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

为深入研究液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用,以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料,利用同源克隆方法得到NHX基因,命名为FtNHX1,并在Gen Bank中注册,登录号为KY438929;序列分析表明,该基因开放阅读框1 662 bp,共编码553个氨基酸,预测蛋白分子量61.24 kDa,等电点5.15。系统进化树分析表明,FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近,氨基酸同源率分别为60.22%,58.95%和57.30%;荧光定量PCR分析表明,随着Na Cl胁迫浓度的增加,FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的相对表达量极显著增加,150 mmol/L NaCl胁迫下增加幅度最大,分别比对照增加了254.10%,311.35%和256.18%;Na Cl胁迫下FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%,145.67%和155.94%,茎基部和叶片的平均表达量较高,说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节,FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。     

高糖甜菜BvNHX1基因的克隆及表达特性分析

本研究以高糖甜菜品种‘BS02’为材料,采用同源克隆技术分离其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为BvNHX1。该基因包含有1 659 bp的开放阅读框,编码552个氨基酸,蛋白分子量为61.31 kD,理论等电点为6.31。预测该基因编码的蛋白具有12个跨膜结构域,同时具有Nhap、Na_H_Exchanger和b_cpa1超家族的保守结构域,而且与盐角草、犁苞滨藜、盐地碱蓬等多种藜科植物NHXs聚为一类,属于液泡膜NHX家族中的ClassⅠ成员。实时荧光定量PCR结果显示:在400 mmol/L NaCl、200 mmol/L KCl和15 mmol/L ABA处理下,该基因表达量分别在叶和根中达到峰值,且叶中的表达量均显著高于根中,表明该基因在响应NaCl、KCl和ABA时,可能在叶中发挥的作用远大于根中。本研究结果将为甜菜耐盐分子机理的研究奠定基础,同时为高糖甜菜耐盐性遗传改良提供坚实可靠的依据。     

耐盐小麦中TaSC基因启动子的克隆及调控功能分析

高盐是小麦的主要非生物胁迫因子之一, 发掘小麦耐盐品种中的相关基因, 分析其调控机理, 有助于解析小麦耐盐性机制。本文利用TAIL-PCR和电子克隆的方法, 从耐盐小麦RH8706-49中克隆了耐盐基因TaSC的启动子序列, 命名为ProTaSC。该DNA序列中存在多个顺式作用元件, 包含与非生物胁迫响应有关的ABA响应元件(ABRE)和MYB蛋白结合位点(MBS)各1个。以GUS为报告基因, 对克隆的启动子序列及不同长度的5′端缺失片段的表达活性分析表明, 克隆的全长片段及2个5′端缺失的片段(681 bp和1096 bp)均能启动GUS表达, 而小于等于343 bp的片段不具备启动功能, 说明ProTaSC中从-681位到-343位核苷酸之间的区域为核心启动子区。在ProTaSC:GUS转基因拟南芥的根、叶片、花药、萼片及成熟角果的果荚壳中均检测到GUS蛋白, 而在主茎、花瓣、幼果和种子中没有检测到GUS, 表明ProTaSC是组织表达特异性启动子。对ProTaSC:GUS转基因拟南芥在NaCl (200 mmol L^-1)和ABA (10 μmol L^-1)胁迫处理后的GUS定量分析表明, ProTaSC是受NaCl和ABA显著诱导表达的功能序列。     

结球甘蓝类钙调素蛋白基因BoCML39的克隆与表达分析

类钙调素蛋白作为钙调素蛋白的家族之一,调控植物生长发育、激素调控、病原菌防御及各种胁迫。本研究以结球甘蓝为试验材料,通过克隆获得BoCML39基因,其开放阅读框(ORF)为510 bp,编码169个氨基酸,不含内含子。预测BoCML39蛋白分子量为19.25 k D,等电点为4.35,为亲水蛋白,含有4个EF-hand结构域;系统发育树表明结球甘蓝BoCML39蛋白与白菜CML39蛋白处于同一进化枝,与油菜CML39蛋白、甘蓝CML39蛋白的亲缘关系近;三级结构预测发现该蛋白包含9个α-螺旋结构、5个β-转角、2个β-折叠、7个无规则卷曲和4个似小球状的钙离子结构。qPCR表明干旱(PEG6000,150 g/L)、盐(NaCl,200 mmol/L)、低温(4℃)、高温(37℃)、过氧化氢(H2O2,30 mmol/L)、脱落酸(ABA,100μmol/L)、水杨酸(SA,2 mmol/L)、茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol/L)不同处理条件均能上调结球甘蓝叶和根中BoCML39的表达。研究结果初步证实BoCML39基因响应逆境胁迫(PEG6000,Na Cl,4℃,37℃)、活性氧(H2O2)和激素(ABA,SA,MeJA)调控,为Bo CML39参与植物逆境、活性氧和激素调控信号途径及其功能研究提供科学依据。     

玉米阳离子/质子逆向转运蛋白ZmNHX7的功能鉴定

植物阳离子/质子逆向转运蛋白可以维持细胞内的离子平衡,在抵御离子毒害过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个编码玉米阳离子/质子逆向转运蛋白的基因,命名为ZmNHX7。该基因编码序列(codingsequence,CDS)全长3411 bp,编码一条含1136个氨基酸的多肽链。ZmNHX7基因在玉米各组织部位均有表达,在V7 (第7片叶完全展开)时期的根和茎中表达量较高。在NaCl与LiCl的胁迫条件下,该基因表达量上调。系统进化树分析将ZmNHX7与拟南芥质膜阳离子/质子逆向转运蛋白AtNHX7和AtNHX8归为一类,亚细胞定位结果表明该蛋白定位于细胞膜和核膜上。将ZmNHX7基因转入拟南芥T-DNA插入突变体中,转基因互补株系可以恢复该突变体对Li+的耐受性。这些结果表明, ZmNHX7编码一个玉米质膜阳离子/质子逆向转运蛋白,在缓解Li+对植物的毒害和维持细胞内的离子平衡等方面发挥重要作用。     

甘蔗Na~+/H~+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因SOS1(salt overly sensitive 1)是植物耐盐性的必需基因之一,在植物抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。本研究以小麦EST序列KJ563230为探针,利用电子克隆技术结合RT-PCR,获得一条甘蔗SOS1基因的cDNA序列,命名为ScSOS1(GenBank登录号为KT003285)。序列分析结果表明,该基因全长1403 bp,包含一个1272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸的蛋白质。ScSOS1蛋白的相对分子质量为47.6 kD,理论等电点(pI)为9.12。氨基酸序列分析表明,ScSOS1蛋白具有一个CAP-ED superfamily结构域。生物信息学预测显示,ScSOS1的编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与中间代谢。实时荧光定量PCR分析表明,ScSOS1基因的表达具有组织特异性,在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中均有表达,其中在叶鞘中的表达量最高,根中的表达量最低。此外在NaCl、PEG、ABA、SA和MeJA的胁迫过程中,该基因表达均受到调控,其中受NaCl和PEG诱导后上调表达,均在24 h表达量达最高,分别约为对照组的1.5倍和4.0倍。推测该基因的表达与甘蔗耐盐性和抗渗透胁迫有关。