化学激活对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

 探索了离子霉素结合细胞松驰素B（cytochalasin B, CB）、放线菌酮（cycloheximide, CHX）以及6-二甲基嘌呤（6-dimethylaminopurine, 6-DMAP）等化学物质，对猪卵母细胞激活后发育的影响。试验1，体外成熟卵母细胞分别用15、20、25、30 mol·L-1的离子霉素处理40 min或电激活（1.3 kV·cm-1，80 s,1次脉冲），结果表明，20 mol·L-1组的激活率（69.93±5.80）%显著高于15 mol·L-1组（P <0.05），但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验2，卵母细胞采用20 mol·L-1离子霉素分别激活10、20、30、40、50 min，再用2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，其中，40 min组的卵裂率、囊胚率[（72.40±13.02）%、（25.37±11.43）%]较高，但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验3，卵母细胞经离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，分别用7.5 g·ml-1 CB、10 g·ml-1 CHX、2 mmol·L-1 6-DMAP、7.5 g·ml-1 CB +10 g·ml-1 CHX和7.5 g·ml-1 CB +2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，2 mmol·L-16-DMAP组的激活率、卵裂率和囊胚率[（86.05±4.29）%、（61.77±8.10）%和（21.62±3.31）%] 显著高于7.5 g·ml-1 CB组（P <0.05）与另外几组差异不显著（P >0.05）。试验4，卵母细胞由离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，用2 mmol·L-1 6-DMAP分别处理3.5、5.5、7.5 h，5.5 h组的卵裂率和囊胚率[(66.59±14.36)%和(25.40±10.16)%]高于另外两组，但差异不显著（P >0.05）。结果表明，离子霉素（20 mol·L-1、40 min）+6-DMAP（2 mmol·L-1 、5.5 h）为最佳激活方案。离子霉素激活卵母细胞后，CB与CHX、6-DMAP的互作对卵子的发育有抑制作用。     

猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率影响因素分析

 研究了月龄和卵巢采集后的保存条件对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率的影响 ,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。试验包括 :(1)卵巢保存的生理盐水温度 (2 2、30、37、38.5、4 0℃ )对猪卵母细胞体外成熟和发育潜力的影响。 (2 )卵巢保存时间对猪卵母细胞体外成熟和后期发育的影响。 (3)初情期前后母猪卵母细胞对体外成熟和发育潜力的影响。结果表明 ,(1) 38.5℃保存的卵巢卵母细胞激活后的卵裂率 (79.6 4 % )和囊胚率(18.11% ) ,37℃的卵裂率 (76 .18% )和囊胚     

成熟液中不同添加物对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

试验研究了在成熟液中分别添加0.1% PVA、10% FBS和不同浓度的EGF(20、30、40、50 ng·mL-1)对猪卵母细胞体外成熟的影响,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳务件.结果表明,在成熟液中添加0.1%PVA和10% FBS后,对猪卵母细胞的成熟率影响无显著差异(P＞0.05),对猪卵母细胞孤雌激活后36 h的卵裂率和第6天的桑葚胚率无显著差异(P＞0.05);添加不同浓度的EGF对猪卵母细胞体外成熟率无显著差异(P＞0.05);但是添加30和40 ng·mL-1 EGF组在36 h的卵裂率要极显著地高于添加20和50ng·mL-l EGF的两组(P＜0.01);而分别添加30、40和50 ng·mL-1 EGF 3组处理在第6天的桑葚胚率无显著差异,且极显著地高于添加20 ng·mL-1 EGF组的(P＜0.01).所以,在成熟液中添加0.1% PVA可以替代10% FBS.尤以添加30 ng·mL-1 EGF组对猪卵母细胞的体外成熟效果较好.     

乙二胺四乙酸钠、能量基质、氨基酸对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育的影响

猪的卵巢卵母细胞在含不同剂量葡萄糖+丙酮酸钠的成熟培养基中体外成熟培养44-48 h,检查核成熟率(试验一),进行化学法孤雌激活后,在含不同浓度的乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)和不同剂量的葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的培养基中进行体外培养,检查孤雌激活胚第48小时的卵裂率和第168小时的囊胚发育率(试验二),研究成熟培养基中葡萄糖+丙酮酸钠剂量对卵母细胞体外成熟核成熟率的影响及培养基中不同浓度EDTA-Na和葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的剂量对孤雌激活胚胎体外发育的影响.结果表明:(1)葡萄糖+丙酮酸钠在1倍剂量时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率为(59.3±5.0)%;当剂量加倍时,核成熟率极显著下降(P<0.01),为(51.0±4.4)%.(2)当EDTA-Na浓度增高,囊胚发育率上升,当浓度达50μmol.L-1时囊胚发育率最高,为(7.2±4.1)%,此后随浓度升高囊胚发育率下降;添加适当浓度(25-100μmol.L-1)EDTA-Na对猪孤雌激活胚的囊胚发育有利(P<0.05),当浓度达200μmol.L-1时其有利作用消失.(3)培养基中葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的剂量过高对卵裂率无显著影响(P>0.05),但对囊胚发育不利(P<0.05).可见:(1)适当浓度(25-100μmol.L-1)EDTA-Na对猪早期胚胎体外发育具有促进作用;(2)成熟培养基中能量基质剂量过高会抑制猪卵母细胞体外成熟;(3)胚胎培养基中葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的剂量过高会抑制猪早期胚胎的体外发育.     

山羊卵母细胞孤雌激活和孤雌胚体外发育的研究

用离子霉素、乙醇、电刺激和Ca-A23187对体外成熟山羊卵泡卵母细胞的孤雌激活和孤雌胚体外发育进行了较为系统的研究。结果表明:2.5,5.0,10.0μmol/L离子霉素对卵母细胞激活率分别为54.0%,58.2%,57.9%,孤雌胚发育率分别为1.5%,3.4%,0%,激活率和发育率均无显著差异(P>0.05)。5.0,10.0,15.0,20.0μmol/L Ca-A23187对卵母细胞激活率分别为31.0%,46.4%,41.8%,45.8%,其中5.0μmol/L Ca-A23187激活率显著低于其他处理组(P<0.05)。5.0μmol/L处理大于4-细胞发育率,极显著低于10.0μmol/L和20.0μmol/L处理(P<0.01),显著低于15.0μmol/L处理(P<0.05)。3%,7%,11%和15%乙醇对卵母细胞激活率分别为40.0%、61.4%、63.0%和67.9%,其中3%乙醇活化率极显著低于其他各组(P<0.01)。15%乙醇致卵母细胞死亡率为15.4%,显著高于其他各组(P<0.05)。7%和11%乙醇处理2~4-细胞和大于4-细胞的发育率,均显著高于3%和15%乙醇处理(P<0.05)。15%乙醇处理大于8-细胞的发育率,极显著低于7%乙醇(P<0.01),显著低于11%乙醇(P<0.05)。在含Ca2 电激液中,用1.00,1.25,1.50,1.80 kV/cm电压刺激卵母细胞,活化率分别为48.4%,54.3%,55.8%,45.1%,2~4细胞卵裂率分别为52.3%,57.9%,54.7%,53.1%,差异均不显著(P<0.05)。     

猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究

通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案。结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高。在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降。在电场强度为1.6kV/cm,电场时程为60μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)、桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)、桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)。成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5μg/mL)、CHX(10μg/mL)、6-DMAP(2 mmol/L)、CB(7.5μg/mL)+CHX(10μg/mL)、CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著。结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率。     

牛体外成熟卵母细胞孤雌激活的研究

比较 3种化学激活方法和 4种电化学激活方法对牛体外成熟卵母细胞进行孤雌激活的效果。结果显示 ,单独用离子霉素和用离子霉素 + 6 DMAP +CB或 +CHX +CB激活牛卵母细胞 ,两者之间差异极显著 (P <0 0 1) ;用不同强度电脉冲 + 6 DMAP +CB激活牛卵母细胞 ,各组间卵裂率差异均不显著 (P >0 0 5 )。结果表明 ,虽然电化学激活方法最高可获得 82 9%的卵裂率 ,比化学激活方法中最好的高 4 8% ,但后者不需电融合仪 ,操作相对简便。     

猪卵母细胞孤雌激活的研究

从卵母细胞孤雌激活的机制及影响因素,猪卵母细胞的激活,猪孤雌胚死亡主要原因,提高卵母细胞孤雌激活效果的技术途径,以及对孤雌激活的研究意义和发展前景等方面,对猪卵母细胞孤雌激活研究进行了综述.     

山羊卵母细胞孤雌激活和孤雌胚体外发育研究

为寻求适合于山羊卵母细胞孤雌激活的方法,本试验采用离子霉素对体外成熟山羊卵泡卵母细胞进行孤雌激活,同时比较了培养液中添加不同类型的血清对孤雌激活胚体外发育的影响。结果表明:用2.5、5.0和10.0μmol/L离子霉素处理卵母细胞,卵裂率分别为72.3%、75.6%和70.3%,囊胚率分别为40.8%、45.4%和39.4%,均无显著差异(P>0.05)。用5.0、10.0、15.0和20.0μmol/L钙离子载体Ca-A23187处理卵母细胞,卵裂率分别为50.5%、62.5%、60.4%和60.2%,其中5.0μmol/L Ca-A23187处理组的卵裂率极显著低于其他处理组(P<0.01),但各组的囊胚率无显著差异(P<0.05)。用30、70、110和150 mL/L乙醇处理卵母细胞,卵裂率分别为40.6%、63.7%、64.2%和65.3%,其中30 mL/L乙醇组的卵裂率极显著低于其他各组(P<0.01),30和150 mL/L乙醇组的囊胚率极显著低于70和110 mL/L乙醇组(P<0.01)。在培养液与颗粒细胞共同培养条件下,分别添加100 mL/L的发情牛血清(OCS)、胎牛血清(FCS)和...     

绵羊卵母细胞孤雌激活及其随后体外发育的初步研究

对绵羊卵母细胞体外成熟培养和孤雌激活的影响因素作了初步研究.卵母细胞在TCM199培养液中培养24 h后,采用1.3 kV/cm、60 μs、0.1 mmol Ca2+和1.4 kV/cm、40 μs、0.1 mmol Ca2+2种处理对成熟卵母细胞进行电激活,卵裂率分别为76.1%和77.0%,2种处理差异不显著(P＞0.05).发生卵裂的卵母细胞在SOFaaBSA培养液中培养(分换液和不换液2种处理)至7～8 d统计囊胚率,换液的囊胚率为12.2%,不换液的囊胚率为22.8%,二者差异显著(P＜0.05).     

成熟培养基对猪卵母细胞的影响

评估NCSU23和TCM199两种培养基对猪卵母细胞体外成熟、孤雌激活以及核移植重构胚发育的影响.分别以NCSU23和TCM199为基础培养基,向其中添加相同浓度的半胱氨酸、激素和生长因子,作为猪卵母细胞体外成熟培养液,培养44h(5％CO2、39℃、饱和湿度),挑选第一极体;成熟后的卵母细胞进行孤雌激活和核移植重构胚操作,144h后观察囊胚数.结果表明,NCSU23组与TCM199组对卵母细胞体外成熟(68.18％和67.55％)、孤雌囊胚率(38.40％和37.60％)与核移植囊胚率(23.79％和21.38％)无显著影响(P＞0.05),但是两者对孤雌囊胚细胞数的影响差异显著(分别为38.4和37.6个细胞)(P＜0.05).NCSU23成熟培养基能够使胞质成熟完全,提高囊胚细胞数,有利于妊娠的发生.可见,以NCSU23为基础培养基的体外成熟液有利于猪卵母细胞体外发育.     

不同体外成熟时间对猪体外成熟卵母细胞孤雌胚胎发育的影响

对体外成熟33,41.49和57 h的猪成熟卵母细胞进行孤雌激活,并对激活后孤雌胚胎的囊胚发育率进行观察.成熟率方面,33 h组显著低于41,49和57 h组,分别为52.54%,79.19%,93.25%和93.75%(p＜0.05);卵裂率方面,41 h组显著高于57 h组,分别为92.26%和56.17%(p＜0...     

不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响

探讨不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响,以便开发出简易、经济的洗卵液。结果表明,使用TL-Hepes液、DPBS液、TCM-199()液和TCM-199()液作为洗卵液,对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后的早期发育没有显著影响,说明4种洗卵液均可用于猪卵母细胞的洗涤,但DPBS液配制较简易且价格便宜,是最佳的选择。     

不同渗透压及山梨醇浓度对猪体外受精卵早期发育的影响

探讨胚胎培养液中不同渗透压及山梨醇浓度对猪体外受精卵早期发育的影响。结果表明,用NaCl调节渗透压时,猪体外受精卵的囊胚率随着渗透压的升高而增加,当渗透压为320~335mOsm时囊胚率最高;而用山梨醇调节渗透压时,以1.8mg/mL山梨醇调节渗透压至270~285mOsm的效果较好;同一渗透压水平下,培养液中添加山梨醇与未添加的处理组间差异不显著。说明本研究条件下,适当提高胚胎培养液渗透压有利于猪体外受精卵的早期发育。     

培养液体积对猪孤雌胚早期发育的影响

为了探讨培养液体积对猪早期孤雌胚发育的影响,旨在优化猪早期胚胎培养体系。试验一、二、三、四分别把30、20、15、10个枚孤雌激活胚放入60,45,30,15,10,5μL(10个胚胎)的培养滴,第48小时观察分裂率,第168小时观察囊胚形成率。结果表明:试验一:30~60μL组囊胚率略高于10~15μL组;试验二:60μL组的囊胚率略高;试验三:各组分裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05),但45~60μL组分裂率和囊胚率比其他组略高;试验四:15μL组分裂率高于45μL组(P<0.05),15μL组囊胚率显著高于5μL组(P<0.05),其余各组差异不显著。由此表明:30枚猪孤雌胚时,胚胎数∶培养滴体积=1∶(1~2)较好;15~20枚猪孤雌胚时,胚胎数∶培养滴体积=1∶3较好;10枚猪孤雌胚时,胚胎数∶培养滴体积=1∶1.5较好。     

氧分压对猪卵母细胞成熟尧受精及早期胚胎发育的影响

研究利用两种氧分压（5%和20%）培养卵母细胞并进行IVF试验,同时使用两种氧分压培养孤雌（PA）胚胎、体外受精（IVF）胚胎和克隆(NT) 胚胎,以探寻猪的最佳体外培养环境。结果显示：低氧分压不利于猪卵母细胞的体外成熟,其成熟率极显著低于高氧培养的,但对低氧培养的卵母细胞进行IVF时,其卵裂率和囊胚率均极显著高于高氧培养的卵母细胞;IVF进行精卵孵育时,低氧环境下,其胚胎卵裂率和囊胚率均显著高于高氧环境下的;PA胚胎、IVF胚胎和NT胚胎用两种氧分压培养,低氧条件下IVF胚胎的发育能力高于高氧培养的,而PA胚胎和NT胚胎差异不显著。试验结果表明,低氧培养虽不利于卵母细胞的成熟,但有利于其以后的胚胎发育,且低氧环境下IVF胚胎的发育能力高于高氧环境下的。     

猪卵泡液和胎牛血清对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响

本研究探讨了猪卵泡液(pFF)和胎牛血清(FCS)对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。将猪小腔卵泡(直径<2mm)卵母细胞-卵丘复合体(COCs)以15～35枚为一组随机置于添加不同浓度(0、5%、10%、20%)pFF(试验一)或不同浓度(0、5%、10%、20%)FCS(试验二)的改良TCM-199成熟液中培养44～48h,观察卵母细胞的核成熟率和卵丘扩散情况。试验一结果显示,成熟液中添加10%pFF与对照组和添加5%、20%pFF组相比,显著提高猪小腔卵泡卵母细胞的核成熟率(28 2%比20 5%、20 9%、22 3%;p<0 05);添加5%和20%pFF组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵母细胞核成熟率之间差异不显著(p>0 05);添加5%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,添加10%和20%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第4类扩散,而不添加pFF的对照组的COCs卵丘细胞呈现第2类扩散。试验二结果显示,成熟液中添加10%FCS与对照组和添加5%、20%FCS组相比,明显提高猪小腔卵泡卵细胞的核成熟率(60 0%比37 5%、40 2%、43 9%;p<0 05);添加5%和20%FCS组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵细胞核成熟率之间差异不显著(p<0 05);FCS在COCs体外成熟培养的前22～24h促进了卵丘扩散(3个处理组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,而对照组COCs的卵丘细胞呈现第2类扩散)。研究结果表明:(1)成熟液中添加pFF可促使猪小     

受精液中添加β-ME、BSA和咖啡因对猪卵母细胞体外受精后早期发育的影响

进行受精液中添加不同浓度的β-ME、BSA和咖啡因对猪卵母细胞体外受精及其早期发育的影响试验。结果表明,在受精液中添加β-ME(2、10、50μmol/L)对猪卵母细胞体外受精后的早期发育无显著促进作用,当添加浓度过高(250μmol/L)时对早期胚胎发育反而不利;在受精液中添加咖啡因(1、2、4mmol/L)对猪卵母细胞体外受精后的早期发育无显著的促进作用;在受精液中添加BSA(0.1%、0.2%、0.4%、0.8%)对猪卵母细胞体外受精后的早期发育有一定的促进作用,并以添加0.4%BSA的效果最好。     

不同直径卵泡对猪卵母细胞体外成熟的影响

以TCM-199成熟培养猪卵巢表面直径2～3mm,3～5mm和5～8mm卵泡内的卵母细胞,比较了成熟培养液中添加以上各组卵泡液(pFF)对猪卵母细胞体外成熟(IVM)的影响,以成熟培养48h后排出第一极体为成熟标准对猪卵母细胞进行成熟鉴定。结果表明,2～3mm,5～8mm和3～5mm3组卵泡内卵母细胞的体外成熟(IVM)率依次升高,分别为12.7%,31.3%和46.0%,各组间差异显著(P<0.05);添加3～5mm卵泡液的卵母细胞体外成熟率(42.0%)也显著高于5～8mm组(11.0%)和2～3mm组(12.7%)(P<0.05)。试验同时观察记录了不同直径卵泡内卵母细胞的等级,结果发现5～8mm组中A级卵母细胞的比例(37.7%)显著高于3～5mm组(23.9%)(P<0.01),但其B级卵母细胞的比例(45.9%)却显著低于2～3mm(62.1%)组和3～5mm(59.2%)(P<0.05)。这说明,2～3mm,3～5mm和5～8mm3组卵泡中,卵泡直径增大,其在猪卵母细胞体外成熟中的优势渐增。