动物细胞分化与克隆

细胞分化是细胞行使功能的前提条件，是特定基因表达的结果。细胞分化状态的维持需要细胞外环境、细胞与细胞之间信息交流及其细胞内环境等共同作用，从而保证分化细胞染色体的特定空间结构。细胞内环境中细胞核因素的影响可以归结为后生性遗传作用，细胞质因素主要有转录后基因沉默(RNAi)和蛋白质磷酸化作用等。克隆动物的实质是细胞分化过程的逆转。克隆动物的过程及其卵母细胞质中的特殊物质破坏了维持供体细胞分化状态的各种条件，改变了分化细胞染色体的特定空间结构，对分化细胞进行了重新编程。克隆过程中卵母细胞质对体细胞的去分化过程并非完全正确，同时由于体细胞染色体可能存在的变异，导致体细胞克隆效率很低。加强对发育生物学基本问题的研究和对现有克隆动物进行详细的研究分析，并继续改进和完善现有的体细胞克隆操作程序，是提高克隆动物效率的当务之急。     

DNA甲基化与细胞分化

DNA甲基化与DNA遗传信息的传递及组织特异性基因的正确表达存在着十分密切的关系。DNA甲基化受组蛋白H 3和DNA甲基化转移酶的调控;甲基化的DNA与许多的蛋白质共同相互作用,调控基因转录,从而导致基因印迹和基因沉默,使细胞向特定方向分化。本文重点综述了DNA甲基化位点、甲基化转移酶及DNA甲基化相关的蛋白质;DNA甲基化与基因印记、基因沉默的关系及其对细胞分化的影响。     

植物器官的克隆-实践、理论和在人与动物器官克隆中应用的可能性

评述了植物器官克隆的实践和理论，包括克隆器官的发展过程、规律性和研究过程中提出的各种理性认识和克隆器官的应用。在克隆器官的应用部分着重讨论了植物器官克隆的方法和经验是否可以应用于人和动物器官克隆。     

鸡破骨细胞分化因子（chRANKL）的克隆、表达和活性分析

为探讨RANKL以及OPG/RANKL/RANK通路在笼养蛋鸡骨质疏松发生中的作用,进行鸡破骨细胞分化因RANKL（receptor activator of NF-κB ligand）的克隆、表达并鉴定其活性。以成骨细胞总RNA为模板,利用RT-PCR和SOE-PCR技术体外扩增RANKL 基因,将PCR产物克隆至组氨酸标签的融合蛋白表达载体pET-32a(+),在异丙基－β－D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下,实现了chRANKL的有效表达,表达产物纯化后稀释成不同浓度梯度作用成熟破骨细胞观察其生物学活性。结果表明,凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为1200 bp左右,插入片段与Genebank上报道的鸡RANKL序列完全一致。重组表达载体转化BL21后经IPTG诱导获得大小约为64 Kd的重组蛋白,Western印迹表明重组蛋白具有抗原活性;并且纯化后的蛋白能刺激成熟破骨细胞,使骨吸收指数呈剂量依赖性增加,表明具有一定的活性。     

土壤动物与土壤健康

土壤动物与土壤健康息息相关,土壤动物多样性和功能能够灵敏反映人类活动和气候变化引起的土壤扰动。同时,土壤动物还通过与生物和非生物组分间的相互作用对地上生态系统产生反馈作用。当前土壤动物在土壤健康评价体系中的应用相对较少,主要集中在土壤线虫、节肢动物和蚯蚓等类群,仍缺乏基于土壤动物的系统性评价指标。因此,本文围绕土壤动物在指示土壤健康方面的潜力,系统总结了现有基于土壤动物的土壤健康评价指标,强调未来应建立和完善土壤动物基因组信息数据库,挖掘土壤动物的功能性状,加强土壤食物网结构和生态功能的研究,建立集成土壤动物物种多样性、功能性状和土壤食物网的指标体系,从而促进土壤健康和生态系统的可持续发展。     

土壤动物与土壤健康

农田管理措施可显著改变土壤动物群落结构和多样性,影响生态系统服务功能的发挥,并最终影响土壤健康和土壤安全。本研究通过对近20年国内外有关农田管理措施对土壤动物影响的相关报道进行梳理,系统总结了施肥方式、种植方式、耕作模式和喷洒农药4种管理措施对土壤动物群落组成和多样性的影响。在现有分析的基础上,提出了未来对于农田管理措施如何影响土壤动物多样性的研究中需要关注的方向,强调未来应在物种水平上加强农田管理措施对土壤动物多样性影响的认知,应重视农田管理措施下土壤食物网结构与功能的研究,应不断完善基于土壤动物群落的农田土壤健康评价指标,以期为农业土壤健康维持提供理论参考。     

水貂细胞色素b基因(Cytb)克隆、序列分析及与鼬属动物的进化关系

参照水貂(Mustela vison)近缘物种线粒体基因组序列设计引物,通过克隆、测序、再拼接的方法获得6个水貂品种和左家型水貂线粒体Cytb基因全序列.用DNAstar v6.13和DnaSP4.0分析显示,水貂Cytb基因全长为1140 bp,平均碱基含量为29.8%A、13.0%G、30.3%T及26.9%C,检测到12个多态位点,全为转换.用Clusta1X1.8进行多序列比较分析表明,水貂个体间Cytb基因相似性非常高.结合GenBank检索到的14种鼬属动物同源序列,用MEGA4.0基于邻接法分别构建鼬属动物核苷酸序列和氨基酸序列系统进化树,两种进化树得出相似的拓扑结构.结果表明:我国水貂与美洲水貂亲缘较近,与欧洲水貂(M.lutreola)亲缘较远,推算美洲水貂与欧洲水貂分歧时间在中新世.     

紫云英LEAFY基因的克隆与鉴定

紫云英(Astragalus sinicus)作为重要的蜜源植物和绿肥作物,对促进作物增产具有重要作用。根据当地的耕作制度,选育花期适当的品种是紫云英重要的育种目标。LEAFY(LFY)是植物花分生组织的特异基因,而目前关于紫云英LEAFY基因的研究尚无报道。为探究紫云英中LEAFY基因的功能,本研究采用Illumina Hiseq和c DNA末端快速克隆(rapid-amplification of c DNA ends,RACE)技术对紫云英LEAFY基因序列进行克隆;采用生物信息学分析软件对LEAFY基因进行生物信息学分析;采用q RT-PCR揭示该基因在不同组织中的表达特性;采用表达载体构建、侵染以及转基因T2代纯合株系的生长发育表型特征统计分析鉴定紫云英LEAFY基因功能。本研究获得的LEAFY基因全长c DNA长度为1 400 bp(Gen Bank No.MH352146),含有1个1 191 bp长的开放阅读框;编码的蛋白质含有396个氨基酸,含22个α螺旋和5个β折叠,其分子量为44.72 k D,理论等电点为6.41;编码的氨基酸序列与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)等物种的LEAFY蛋白相似性均在80%以上,具有高度的同源性;q RT-PCR分析结果表明,紫云英LEAFY基因在各组织中的表达量由高到低依次为花芽、花、叶、叶芽、根、茎和荚;超表达LEAFY基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)实验结果发现,超表达LEAFY基因拟南芥株系的出苗至抽薹天数比野生型平均早3 d,出苗至开花天数比野生型平均早2 d,开花数比野生型平均多1.79个。本研究表明紫云英LEAFY基因与豆科物种均有较高的同源性,在其花芽中表达量最高,并证实LEAFY基因可能调控其开花机制,为通过分子技术改良该物种成花提供理论依据,对农业生产具有重要意义。     

大肠杆菌yqhD基因的克隆与表达

以大肠杆菌E scherich ia coli K-12基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到假定的氧化还原酶(pu tative ox idoreductase)基因yqhD,将它连接到克隆质粒pGEM-3zf(+)上,得到重组质粒pGEM-yqhD,对此重组质粒进行序列测定,对其DNA序列分析表明,yqhD基因全长为1 164 bp。再将yqhD基因插入表达载体pSE 380,构建成重组子pSE 380-yqhD,并在E.coli BL 21中获得表达。研究表明,以1,3-丙二醇为底物时,基因工程菌在30°C下,以1.0 mm o l/L IPTG诱导12 h的酶活力达到3.13 U/mL,比对照菌株提高4.4倍。     

燕麦AsKUP1的克隆与功能分析

植物钾离子转运蛋白中的Na~+不敏感性KUP/HAK/KT转运蛋白对植物耐盐胁迫起着重要作用。为了阐明钾离子转运蛋白基因AsKUP1在燕麦中响应盐胁迫的表达模式和鉴定其生物学功能,从燕麦中克隆了AsKUP1,利用RACE方法获得AsKUP1全长序列,并对其进行生物信息学分析;构建了pCAMBIA1301-AsKUP1植物过表达载体,转化拟南芥,并运用实时荧光定量PCR方法分析AsKUP1在拟南芥中的表达情况。结果表明,AsKUP1全长2 951bp,包含2 334bp的ORF序列,预测编码777个氨基酸,等电点为8.55,分子量为87.0k D。序列分析表明,AsKUP1与山羊草和小麦KUP/HAK/KT家族亲缘关系较近,预测该蛋白有14个疏水跨膜结构域,位于细胞质膜的概率较大。此外,盐胁迫下,T2转基因种子萌发率为57%,野生型为43%;经潮霉素筛选分离比为3∶1的2个转基因株系后代T3转基因株系根长分别是野生型的1.46倍和1.34倍,T3转基因植株鲜重、干重分别是野生型的1.56倍和1.44倍,Na~+含量无显著差异,而K~+含量为野生型的1.25倍,说明AsKUP1的表达提高了拟南芥植株的耐盐性。本研究结果为揭示钾离子转运蛋白家族基因AsKUP1在植物中的耐盐机制和通过转基因技术提高植物耐盐能力奠定了基础。     

药用动物资源学与动物药学科建设发展现状及展望[

中药材在采收后需经过产地初加工处理,其中干燥是产地初加工的必要环节,并直接影响到中药材的品质。传统的自然干燥方式效率低,且药材干燥品质良莠不齐,严重制约中药产业的发展。因此,加强对中药材干燥技术与装备的研究尤为迫切。基于此,该研究综述了中药材干燥技术与装备的研究现状。首先,总结中药材的干燥脱水过程与理化性质变化规律,分析了药材自身特性与干燥条件对水分脱除速率与干燥品质的影响机制。其次,针对热风、热泵、红外、微波、真空与高压电场干燥技术,以干燥机理为基础,总结各类干燥技术的装备结构与工作原理,分析了干燥装备存在的干燥不均匀、能耗大、效率低等问题并探讨了相应改善方法。同时,研究了各类干燥技术在不同工艺条件下的干燥效果,分析了干燥温度、切片厚度、真空度等工艺参数对干燥效果的影响规律,探讨了预处理、阶段式变温变湿、间歇式干燥等赋能干燥效果的工艺手段,并综合干燥品质、干燥效率与干燥成本,得到了各类干燥技术的优缺点与适用范围。进一步地,分析了微波-真空、微波-热风与远红外-热泵三类联合干燥技术不同组合方式下的干燥机理,阐述了各类联合干燥装备的研发进展,探讨了联合干燥技术相较于单一干燥技术的优势以及装备和工艺存在的不足。最后,从提高中药材品质评价标准、完善干燥相关模型、加强干燥装备研发三方面对研究方向进行了展望,以期为中药材干燥技术研究与装备创新研发提供理论依据与技术支持。

     

鸽子GR基因cDNA克隆与表达分析

糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)是保守的核受体超家族中的一员,属于核转录因子,GR对维持机体稳态起着重要作用,同时在动物繁殖代谢过程中扮演着重要的角色.本研究旨在克隆鸽子(Columba livia domestica) GR基因的cDNA全长并分析其组织表达谱.参照鸡(Gallus gallus domesticus)的GR基因序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了鸽子的GR基因的cDNA序列.测序结果表明,鸽子GR基因包含有2313bp的全长CDS序列,102bp的5'UTR序列,以及18 bp的3'UTR序列,共编码770个氨基酸(GenBank登录号:NM001037826.1).通过序列同源性分析发现,鸽子GR氨基酸序列与鸡的同源性为94％,与短吻鳄(Alligator mississippienses)的同源性为85％,与人(Homo sapiens)的同源性为75％.通过与鸡、鳄鱼和人的氨基酸序列比对分析发现,鸽子的GR氨基酸序列中有一个非常保守的DNA结合区(DNA binding domain,DBD)和一个保守性较高的激素识别区(hormone recognition domain, LBD),此外还包括一个GR特异区域.利用qRT-PCR技术发现在鸽子不同组织中均有表达,表达量由高到低依次为睾丸、胰、肺、卵巢、腹部脂肪、肝、心、骨骼肌、肾、脾、输卵管、胃、下丘脑、大脑、肠和嗉囊.睾丸中表达量显著高于其他组织(P＜0.05),其次为胰腺和肺(P＜0.05),在嗉囊中的表达量显著低于其他各组(P＜0.05).本研究获得鸽子GR基因cDNA全长、组织表达规律,为进一步研究鸽子GR基因的功能提供了基础资料.     

大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.     

水稻OsGPDH1的克隆与功能鉴定

为了解水稻甘油-3-磷酸脱氢酶基因在水稻抗逆性中的作用,本研究从水稻品种日本晴中克隆了1个编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因,命名为OsGPDH1,该基因编码的蛋白酶具有NAD(P)+结合域和脱氢酶域,且这2个结构域在植物中高度保守。构建过表达OsGPDH1基因载体转化水稻得到转基因植株,RT-qPCR分析表明,OsGPDH1基因在水稻孕穗期的叶、幼穗、茎、节、叶鞘中均有表达,说明该基因参与了水稻的生长发育过程。OsGPDH1基因也受到PEG6000、高盐、双氧水等逆境和甲基茉莉酸(mJA)、水杨酸(SA)等激素诱导表达,且诱导12h后,OsGPDH1的表达量达到最高水平,但对脱落酸(ABA)不敏感。盐胁迫下的发芽试验表明,过表达转基因水稻的发芽率高于野生型,说明OsGPDH1基因表达量的提高可增强转基因植株对盐胁迫的耐受性。对过表达OsGPDH1的转基因水稻进行苗期20%PEG6000胁迫处理后,转基因水稻的成活率显著高于野生型,说明OsGPDH1基因过表达可提高水稻苗期抗旱能力。本研究初步证明了OsGPDH1水稻抗盐胁迫和渗透胁迫的重要作用,为培育抗性转基因水稻新品种提供了新的基因资源。     

菜心BrcuFCA基因的克隆与表达分析

本文以菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis（L.）Makino var.utilis）为实验材料,比较了Trizol法、改进Trizol法及改良SDS法提取菜心总RNA的效果。结果表明改进Trizol法集中了操作简单、耗时短、所需试剂种类少,且完整性好,产量和纯度均高等多重优点,成为提取菜心总RNA首选方案。同时文章以甘蓝型油菜及其它物种的FCA保守区设计引物,将质量高的菜心总RNA反转录合成cDNA,通过RT-PCR从菜心的早、晚熟品种中均克隆得到与开花有关的基因片段,将之命名为BrcuFCA,片段长1001bp,GenBank登录号为EU700363,与甘蓝型油菜及拟南芥FCA氨基酸同源性分别达到了98%和82%。另一方面,本研究还利用半定量RT-PCR研究了BrcuFCA不同时空表达特性,并结合已发表的开花调控遗传途径中两个关键基因BrcuFLC和BrcuFRI时空表达特性研究结果,推测菜心主要的抽薹开花途径不是春化和FRI-依赖途径,而很可能是自主开花途径。本研究为菜心抽薹开花分子机理的研究提供理论依据。     

苎麻α-amylase基因的克隆与表达

α-amylase基因不仅参与植物糖代谢与生物能量的调动,而且与植物抗逆功能相关。为了克隆Bn-α-amylase基因,分析其序列及表达特征,本研究以湘苎3号苎麻(Boehmeria nivea)转录组文库中Unigene4746序列为基础,采用RT-PCR技术克隆该基因的全长编码序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下的表达特征。研究结果表明,苎麻Bn-α-amylase的编码区序列长2 295 bp,编码765个氨基酸(GenBank登录号:KF860891),推导该蛋白质的等电点和分子量分别为5.685和86.11 kD,该蛋白在羧基端含有两个保守的结构域,亚细胞定位预测显示该蛋白位于细胞质中,不存在信号肽和跨膜结构域。与苹果(Malus×domestic)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、猕猴桃(Actinidia chinensis)、蓖麻(Ricinus communis)、大豆(Glycine max)的α-amylase基因的核苷酸序列相似性分别为80%、76%、76%、73%和67%,与之编码的氨基酸序列相似性分别为68%、65%、65%、69%和51%。进化树分析表明Bn-α-amylase与大豆、葡萄、猕猴桃、蓖麻的α-amylase基因亲缘关系较近,与拟南芥、水稻、高粱的α-amylase基因亲缘关系次之,与卷柏的α-amylase基因亲缘关系较远。实时荧光定量PCR分析表明,Bn-α-amylase在苎麻根、茎皮、茎木质部、茎尖、叶片中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低,且受干旱、高盐胁迫表达增强,受ABA胁迫表达降低。本研究获得了Bn-α-amylase基因的编码区序列,其编码的蛋白具有植物α-amylase典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,提示该基因可能与苎麻抗逆境机制密切相关。     

壳聚糖酶基因的克隆与序列分析

本研究采用一对引物从巨大芽孢杆菌BS-0409中成功地克隆了壳聚糖酶基因（Csn） 全基因序列,大小为516bp,将其在NCBI网站上用BLAST程序进行在线检索分析,结果与多种芽孢杆菌同源性均为96%。同时,利用DNAMAN软件比较巨大芽孢杆菌BS-0409与其它13种不同细菌Csn编码基因的氨基酸序列,结果显示不同细菌Csn氨基酸序列之间有比较高的同源性,且与多种芽孢杆菌具有较高的同源性。     

石榴PAL基因的克隆与表达分析

为探究石榴PAL基因的功能及表达特性,解析石榴呈色和褐变机理,以石榴品种泰山红和泰山三白甜为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆PAL基因全长,分析其在不同发育期的表达情况。结果表明,从泰山红果皮c DNA中克隆得到石榴PAL基因(Gen Bank登录号为KY094504)。PAL基因ORF序列长2 205 bp,编码734个氨基酸,含有典型的苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构域、PLN02457结合位点和PLN02457超家族保守结构域;石榴PAL编码蛋白的预测分子质量为79 693.87 Da,为稳定蛋白和亲水性蛋白,存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3个磷酸化位点,二级结构中含有丰富的α-螺旋(47.55%)和无规则卷曲(30.52%);实时荧光定量PCR分析表明,泰山红和泰山三白甜果实发育过程中,PAL表达水平呈先降低后升高的变化趋势,泰山红果实发育各时期果皮中PAL表达水平均高于泰山三白甜;2个品种发育期果皮褐变度逐渐降低,且泰山三白甜褐变度明显高于泰山红;泰山红果实发育期果皮花青苷含量逐渐升高,泰山三白甜变化较平缓,且泰山红花青苷含量明显高于泰山三白甜。2个品种PAL基因表达量与褐变度呈显著正相关,泰山红PAL基因表达量与花青苷含量呈极显著负相关。本研究结果为揭示石榴果实呈色和褐变机理提供了理论依据。