酸诱导分离家兔X、Y精子研究

利用X精子在酸性环境条件下的运动活性比Y精子强的原理,通过酸诱导,用王氏管分离法(实时精子分离技术)分离家兔X、Y精子,同时利用体视显微镜评定所分离精子的活率,并用喹吖因染色法进行鉴定。结果表明,在稀释液pH为5．5时分离效果最好,分离后目的精液精子活率平均达(91±1．4)％,较分离前平均精子活率(82±1．3)％提高了9．1％,两者差异极显著(P<0．01);分离后的精液中,X精子的比例为(73．3±1．0)％,Y 精子的比例为(26．7±1．0)％,与分离前精液中X、Y精子各占50％的比例差异均极显著(P<0．01),表明酸诱导条件下的王氏管分离法是X、Y精子分离简单有效的方法。     

Sry基因探针FISH检测奶牛XY精子纯度

为探讨荧光原位杂交技术（FISH）在评价奶牛精子纯度方面的应用价值，制备地高辛标记Sry基因探针，对分选X、Y精子及常规精子标本进行RNA水平的精子荧光原位杂交分析。结果显示，荧光原位杂交测定分选X、Y精子及常规精子纯度分别为94.6%、93.3%、50.3%，与对应精子纯度比较差异不显著（P>0.05），杂交信号多出现在精子尾部中段。可见：建立的Sry基因探针FISH方法评价奶牛精子纯度鉴定结果准确可靠，为其他精子纯度评价方法提供可靠的技术支持。     

奶牛精子SRY基因原位杂交检测方法的建立

Sry基因是Y染色体性别决定基因,采用primer premier 6对SRY基因序列设计引物,以公牛基因组DNA为模板扩增,高效DNA地高辛标记和检测试剂盒制备探针,对X精子(Y精子纯度7％)、Y精子(Y精子纯度93％)和常规精子(Y精子纯度50％)DTT去凝集、蛋白酶K去除鱼精蛋白,杂交.结果表明:在荧光显微镜下可见标本背景清晰,精子头部成蓝色,边界清楚,X精子4.67％ (n =600)有荧光信号,Y精子86.33％(n=600)有荧光信号,常规精子46.17％有荧光信号.实验证明了所选取Sry基因序列为Y精子携带,建立了精子原位杂交方法.     

马氏珠母贝精子质量形态评定中不同染色法染色效果的比较

为筛选出适宜于马氏珠母贝Pinctada martensii精子形态分析的染色方法,采用曙红Y和结晶紫染液对不同方法制作的马氏珠母贝精液抹片进行染色,并通过显微镜观察比较染色效果。结果表明：1）采用将精液先抹片后染色（0.8 mg/mL曙红Y染液）的方法时,精子头部着色不完全,染色效果不随染色时间的延长而改善,精子形态特征不明显,故该方法不适于精子形态检测;2）将精液与20 mg/mL的曙红Y染液等体积混合后抹片,精子头部着深红色,尾部着浅红色,精子各部分结构清晰,形态特征明显,背景干净,对比明显;3）用5 mg/mL的结晶紫染液对精液进行渗透染色时,精子形态染色特征明显,头部着深紫色,尾部着浅紫色,背景干净,可较准确地判断精子的形态特征;4）依精子形态对马氏珠母贝精子进行分类,并确定了主要的畸形类型及其特点,马氏珠母贝精子畸形主要集中在精子的颈部和尾部,头部畸形情况较少;5）采用两种染色方法判定的正常精子率之间无显著差异（P〈0.05）,数据稳定,因此,这两种染色方法均可用于马氏珠母贝精子形态的评价中。     

不同pH人工精浆对性逆转金鳟雄鱼精子活力的影响

研究了性逆转金鳟雄鱼（XX,伪雄鱼）精子在不同pH的人工精浆（ artificial seminal plasma,ASP）溶液中的活动情况。结果显示,随着pH的提高精子活力不断增强。伪雄鱼精子在不同ASP—pHs中培养1h后,pH9．5～10．5培养组精子活力超过正常雄鱼精子（XY）活力水平,且正常雄鱼精子与pH8．5～9．5培养组的精子活力不存在显著性差异（P〉0．05）。将金鳟伪雄鱼精液培育在pH8．5～10．5的ASP中,0～180min内,pH10．5中的精子寿命和激活比例都最佳,180min之后的精子寿命超过80s,激活比例在90％以上,显著好于其他pH组（P〈0．05）。在低温储藏12h后,正常雄鱼精子在ASP—pH10．5溶液中寿命时间最长,为（284．05&#177;78．37）S,其次是同等稀释条件下的伪雄鱼精子寿命,其时间为（203．89&#177;43．68）s,正常雄鱼精液原浆精子寿命最短,为（122．19&#177;37．61）s。直接用金鳟伪雄鱼精液受精,发眼率和仔鱼上浮率仅为12．50％和8．77％,而通过pH10．5的ASP培养后,其发眼率和孵化率分别提高到了52％和49．95％。因此,在高pH的ASP中培养金鳟伪雄鱼精子能提高其活力和延长寿命。通过这种处理也能够显著的提高金鳟全雌和全雌三倍不育后代的育苗生产效率。     

不同pH人工精浆对性逆转金鳟雄鱼精子活力的影响

研究了性逆转金鳟雄鱼（XX，伪雄鱼）精子在不同pH的人工精浆（ artificial seminal plasma,ASP）溶液中的活动情况。结果显示，随着pH的提高精子活力不断增强。伪雄鱼精子在不同ASP—pHs中培养1h后，pH9．5～10．5培养组精子活力超过正常雄鱼精子（XY）活力水平，且正常雄鱼精子与pH8．5～9．5培养组的精子活力不存在显著性差异（P〉0．05）。将金鳟伪雄鱼精液培育在pH8．5～10．5的ASP中，0～180min内，pH10．5中的精子寿命和激活比例都最佳，180min之后的精子寿命超过80s，激活比例在90％以上，显著好于其他pH组（P〈0．05）。在低温储藏12h后，正常雄鱼精子在ASP—pH10．5溶液中寿命时间最长，为（284．05&#177;78．37）S，其次是同等稀释条件下的伪雄鱼精子寿命，其时间为（203．89&#177;43．68）s，正常雄鱼精液原浆精子寿命最短，为（122．19&#177;37．61）s。直接用金鳟伪雄鱼精液受精，发眼率和仔鱼上浮率仅为12．50％和8．77％，而通过pH10．5的ASP培养后，其发眼率和孵化率分别提高到了52％和49．95％。因此，在高pH的ASP中培养金鳟伪雄鱼精子能提高其活力和延长寿命。通过这种处理也能够显著的提高金鳟全雌和全雌三倍不育后代的育苗生产效率。     

南美白对虾精子超低温冷冻保存技术研究

【目的】建立一种南美白对虾精子超低温冷冻保存方法,为南美白对虾优良种质的长期保存奠定基础。【方法】利用胰蛋白酶消化法获得游离的南美白对虾精子,分别使用灭菌天然海水、无钙人工海水、3％等渗NaCl溶液和0．9％生理盐水作为基础液,并以不同浓度的二甲基亚砜（DMSO）、甘油、甲醇及其与海藻糖的混合溶液作为抗冻剂,在4种不同降温程序下超低温冷冻保存南美白对虾精子,然后在不同的温度下复苏冷冻精子,以伊红-苯胺黑染色法检测精子存活率。【结果】使用1．00g／L胰蛋白酶消化精荚5min能获得大量游离的南美白对虾精子,以灭菌天然海水为基础液,以10％DMSO和0．25mol／L海藻糖为抗冻剂,在P．1降温程序（4℃平衡30min,以．5℃／min的速率降至-20℃;-20℃平衡5min,以-10℃／min的速率降至-80℃;-80℃平衡5min,然后置于液氮中保存）下超低温冷冻保存南美白对虾精子,经37℃水浴复苏后精子存活率最高。【结论】建立的南美白对虾精子超低温冷冻保存方法具有可行性,为南美白对虾精子冷冻保存库的建立提供了技术支撑。     

鄱阳湖区黄鳝精子活力周年观察

对鄱阳湖区雄性黄鳝性腺中精子活力周年观察中发现黄鳝性腺中3月中旬至11月中旬均可见到活动精子；其中4月中旬至9月中旬的黄鳝精子激活后可见到作剧烈无序运动的精子．3月、10～11月的性腺中精子仅微微活动；其它时间未见活动精子。繁殖高峰期．初步研究不同浓度NaCl溶液对黄鳝新鲜精液活力的影响及精子的呼吸强度。实验结果表明．在浓度为0．1％～0．4％NaCl溶液中精子被激活．精子激活率以0．2％NaCl最高。在浓度为0．5％～0．7％NaCl溶液中精子活力被抑制．很少见剧烈运动精子。精液品质较佳的使美蓝显色剂褪色时间为30～35min，精液品质较差的精液使美蓝显色剂褪色时间较长。     

复方中草药对凡纳滨对虾生长性能和血清非特异免疫因子的影响

以凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei为对象,投喂添加不同水平的复方中草药饲料,研究中草药对凡纳滨对虾生长性能和血清非特异免疫因子的影响。试验共分7组,A—F组饲料中分别添加质量分数为0．5％、0．9％、1．3％、1．7％、2．1％、2．5％的复方中草药,对照组饲料中不添加。饲养试验共进行56d。结果表明：随着复方中草药添加水平的提高,凡纳滨对虾的增重率和特定生长率逐渐增加,仅F组与对照组差异显著（P〈0．05）;饲料系数和成活率各组间均无显著差异（P〉0．05）;增重率与复方中草药添加水平的回归方程为Y=-125．86X^2＋521．93X＋6063（R^2=0．9561）。由方程可知：当复方中草药水平为2．07％时增重率最高;对虾血清中超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酚氧化物酶和溶菌酶随着复方中草药添加水平的增加表现出先显著增加然后下降的趋势,E组中4种酶活力均最高;复方中草药对酸性磷酸酶和过氧化物酶活力没有显著影响。     

牛X、Y精子差异表达基因筛选与性控DNA疫苗的研究

本课题按照课题计划任务书的进度要求，已完成流式分离≥99％纯度奶牛X、Y精子样本准备和纯度验证以及奶牛精子总RNA提取纯化的关键技术研究，高纯度牛X精子和Y精子作为材料，采用固相支持物磁珠扣除杂交和低丰度mRNASuperSMART技术构建Y—X扣除杂交cDNA质粒库，克隆菌落PCR鉴定后，     

反相高效液相色谱法同时测定金银花中的绿原酸和木犀草苷方法的优化

[目的]研究反相高效液相色谱法同时测定金银花中的绿原酸和木犀草苷的优化色谱条件.[方法]采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量,并对色谱条件进行优化.[结果]最佳色谱条件为色谱柱Waters SunFireTMC18（4.6mm＆#215;150 mm,3.5 μm）、柱温40℃,流动相为乙腈-0.5％冰醋酸,梯度洗脱为0～15 min（10：90～20：80）、16 ～ 17 min（20：80 ～ 10：90）,流速1.0 ml/min,检测波长0～15 min 328 nm、16 ～ 17 min 350 nm.[结论]优化后缩短了测试时间,为金银花质量的快速检测提供参考依据.     

高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量

为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法,通过超声提取,离子交换萃取小柱净化,结合高效液相色谱进行样品测定．色谱条件：EclipseXDB—C18柱（5μm,4．6m／n×150mm,ASilent）;流动相：A为离子对缓冲液（1．05g柠檬酸和1．01g辛烷磺酸钠定容至500mL,pH值为2．6）,B为乙腈,配制比例为90％A＋10％B,流速1．0mL／min,柱温30℃,进样量20止,检测波长240nm．结果表明：三聚氰胺标准曲线为Y=0．009z＋0．3627,相关系数R=0．9998,在0．17—110．0mg／L范围内线性关系良好,方法检出限为0．12mg／L,两个样品三个水平的加标回收率分别为96．34％（RSD=4．76）、84．86％（RSD=7．21）、104．29％（RSD=7．63）和95．31％（RSD=4．39）、89．25％（RSD=3．88）、92．59％（RSD=5．27）．     

印度洋中南部长鳍金枪鱼生物学特性的研究

根据2008年9月—2009年4月印度洋中南部金枪鱼延绳钓渔场所捕获的长鳍金枪鱼Thunnus alalun-ga数据,对该鱼种的生物学特征进行了分析。结果表明：1）叉长为74~120 cm,优势叉长为105~110cm,约占总数的47.8%,平均叉长为（107.2±4.99）cm。2）长鳍金枪鱼叉长（LF,cm）与加工后重（WD,kg）的关系可表达为WD=1.7146×10-5LF3.0197（总体）,WDM=7×10-5L2F.M7229（雄性）,WDF=2×10-6L3F.F5354（雌性）。3）调查期间,长鳍金枪鱼性腺成熟度以Ⅳ级为主,约占总数的43.1%。4）当长鳍金枪鱼叉长小于100 cm时,摄食等级以0级和2级为主;当叉长为100~120 cm时,空胃率达39%以上,且随叉长的增长而递增。当叉长为91~110 cm时,摄食饱满指数随叉长增长而上升;当叉长为111~120 cm时,饱满指数随叉长递增而降低。     

食蟹猴精液低温保存研究

【目的】探讨食蟹猴精液低温保存液的最佳配方,为食蟹猴精液冷冻保存和品质鉴定奠定基础。【方法】测定生理温度（37℃）、常温（15～25℃）和低温（0～5℃）3种状态下,食蟹猴精子在不同保存液中的存活时间及存活指数。【结果】生理温度（37℃）和常温（15～25℃）下,食蟹猴精子在TALP液中的存活时间分别为12.94±5.57和58.59±40.91 h,存活指数分别为4.88±1.97和24.48±17.94;而低温（0～5℃）下,食蟹猴精子在TRIS液添加20%蛋黄的保存液中存活时间及存活指数分别为596.00±83.35 h和283.05±49.42,显著高于其他处理（P＜0.01）。【结论】TRIS液添加20%蛋黄是食蟹猴精液低温（0～5℃）保存液的最优配方。     

乌拉坦对鲫的麻醉效果

在鲫Carassius。啪￡峪适宜生存温度（室温为15—25℃）条件下,研究了10、20、30、40、50g／L的乌拉坦（Urethane）溶液（pH为7．0＋0．44）对鲫（体质量为230g±9．46g）的麻醉效果,探讨了乌拉坦对水生动物的麻醉作用,并提供日常实用的麻醉参数。结果表明：乌拉坦浓度为10～50g/L时,麻醉时间随着乌拉坦浓度的增大而缩短,复苏时间随着乌拉坦浓度的增大而延长,但浓度为50g／L时与浓度为40g／L时相比,鲫的复苏时间无显著性差异（P〉O．05）;浓度为10-40∥L时,各组鲫的复苏率均为100％,浓度为50g/L时,鲫的复苏率为88％;浓度为10-50g/L时,各组鲫7d的存活率均为100％。鲫在不同浓度（10～50g／L）的乌拉坦溶液中药浴一定时间后,将其暴露于空气中,经过一定时间后鲫可自动苏醒而弹起。其中除50g／L浓度组与40g／L浓度组之间,鲫的弹起时间无显著差异（P〉0．05）外,其余浓度组之间鲫的弹起时间均有显著差异（P〈0．05）;各浓度组药浴时间为10min与5min之间,鲫的弹起时间无显著差异（P〉0．05）,10g／L组的药浴时间为25min与20min之间,鲫的弹起时间无显著差异（P〉0．05）,各浓度组其余药浴时间之间均有显著差异（P〈0．05）。各试验组鲫7日存活率均为100％。药浴后的鲫能够恢复正常行为状态,表明乌拉坦对鲫行为的影响无明显的后遗效应。综合各项试验结果,表明乌拉坦对鲫的麻醉安全浓度为40g／L。     

HPLC法测定白蜡树叶中秦皮甲素含量

[目的]测定白蜡树叶中秦皮甲素的含量。[方法]样品经无水甲醇回流提取,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-浓度0.1%磷酸溶液(8∶92,V/V)为流动相,检测波长334 nm,柱温30℃,流速1.0 ml/min,采用高效液相色谱法测定含量。[结果]平均回收率为96.59%,RSD为2.39%(n=6);白蜡树叶中秦皮甲素的平均含量为0.155 9 mg/g。[结论]该方法稳定性好,精密度高,重现性好,可用于白蜡树叶中秦皮甲素的含量测定。     

溴氰菊酯对加州腔蚓的急性中毒效应

于不同时间地点观察加州腔蚓在溴氰菊酯浓度为40mg／kg、20mg／kg、10mg／kg、5mg／kg、2．5mg／kg土壤中的急性中毒症状、异常行为及死亡状况,结果发现：与低浓度相比,高浓度（≥20mg／kg）下蚯蚓环带红肿、粘液分泌、身体翻滚等症状出现的时间较短,不足7min,在浓度为2．5mg／kg时上述症状出现的时间最长,约为60min;蚯蚓中毒翻滚持续时间,在40mg／kg浓度下最短,为233．1min,在2．5-10mg／kg浓下时持续最长,约600min;蚯蚓中毒致死时间,在40mg／kg和5mg／妇浓度下达极值,分别为317．9min和2140min,前者死亡时体重下降9．48％,后者死亡时体重下降近30％。统计分析表明：溴氰菊酯对加州腔蚓的急性毒性效应与中毒时间和农药剂量存在相关性。     

不同贮藏温度对小黑麦花粉活力的影响

在室温、4℃、-20℃和液氮(-196℃)下贮藏小黑麦的花粉,研究不同温度对新小黑麦1号、3号、4号和5号花粉活力的影响,结果表明:室温条件下保存3 h,小黑麦花粉活力均在80%左右,3~4 h后花粉活力降低很快,7~8h后花粉活力几乎全无。4℃保存可适当延长花粉活力,保存8 h后,新小黑麦1号、5号花粉的活力降低到60%,而3号和4号降低为80%左右。48 h左右花粉活力降至0%。与4℃相比,-20℃保存下不同品种小黑麦花粉活力降低更快,4 h后花粉活力降低到50%~65%,16 h后花粉活力接近0%。液氮超低温冷冻保存下小黑麦花粉活力相对稳定,保存10天后活力仍然很高,其活力相对保持率在92%左右,理论上可以长时间保存花粉。     

不同激活剂对兔卵母细胞孤雌激活效果的研究

目的:探寻一种稳定有效的卵母细胞激活方法,为兔体细胞核移植提供实验基础。方法:兔超排后获得卵母细胞体外成熟22~24 h,经脱颗粒处理后采用不同激活剂和不同处理时间进行激活,体外培养5~7 d,观察胚胎发育与囊胚形成情况。结果:卵母细胞经过离子霉素作用5 min或者乙醇作用7 min均能被激活,但两者卵裂率、囊胚率都较低;乙醇和离子霉素分别与6-DMAP联合激活兔卵母细胞时,离子霉素+6-DMAP处理组卵裂率(73.7%)显著高于乙醇+6-DMAP处理组(38.5%,P<0.05);与离子霉素联合激活时,2.0 mmol/L的6-DMAP处理5.0 h时的卵裂率和囊胚率最高,达75.6%和45.5%。结论:激活方法对兔卵母细胞孤雌激活率的影响很大,不同激活剂的联合应用及激活剂的作用时间对兔卵母细胞的激活存在显著差异。