新型分子标记―SRAP技术体系优化及应用前景分析

基于PCR的分子标记技术很多,但均因自身缺点限制了发展和应用。一种新兴的分子标记技术－相关序列扩增多态性SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism）以其特有的优点得到日益广泛的应用,显示了良好的发展前景。此技术在国外较多应用,但国内利用较少。以西瓜为材料对技术体系各影响因素进行调整,优化反应体系,比较DNA提取方法,调整银染技术,得到很好的扩增效果,同时对SRAP的原理、特点和应用前景进行了介绍。研究表明,SRAP将成为研究领域一个有力的工具。     

分子标记在青稞中的应用现状及前景

分子标记反映了DNA分子的多态性,可以作为研究生物遗传变异和进化关系的重要手段.本文介绍了常用分子标记技术的原理、方法、特点及其在青稞上的应用现状,同时展望了分子标记技术在青稞上的应用前景.     

柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化

通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、PCR反应体积、Mg2 浓度、dNTP浓度、Taq酶用量、引物量)、电泳检测方法的系统优化,建立了柑桔SRAP-PCR和ISSR-PCR体系;以此进行大规模引物筛选,从而建立了柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系.SRAP-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10 mmol/L,KCl50 mmol/L,Mg2 1.2 mmol/L,dNTP 120 μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.4μmol/L,反应程序为94℃预变性5min,35个循环(94℃ 30s,47℃ 1min,72℃ 1min),72℃延伸10min;ISSR-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2 1.6 mmol/L,dNTP200μmol/L,Taq酶1 U,引物0.8μmol/L.筛选出稳定性好、多态性高的24对SRAP引物和13条ISSR引物.     

蝴蝶兰随机扩增多态性DNA分子标记体系优化

采用改良的SDS法提取蝴蝶兰叶片基因组DNA,并以其为模板对影响随机扩增多态性DNA(RAPD)扩增反应的主要因子采用递进分析方法进行优化,建立了蝴蝶兰RAPD反应体系.结果表明,所提DNA达到10 ng/μL,优化后的20μL反应体系为:10 mmo]/L的dNTPs0.5μL,10 ng/μL的模板DNA0.5μL,25 mmol/L的MgCl2 2.4μL,2 U Taq聚合酶,10μmol/L的引物0.5μL,10×Buffer溶液2μL,双蒸水15.7μL.优化后的扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,36 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,42次循环,最后72 ℃延伸10 min.     

木薯SRAP扩增体系的建立与优化

建立适宜木薯DNA的SRAP扩增体系,为木薯分子标记和基因图谱的构建打下基础。以木薯基因组DNA为模板,采用序列相关扩增多态性(sequence related amplified polymorphism,SRAP)技术对木薯DNA进行PCR扩增,逐级优化反应参数。最佳SRAP-PCR反应体系(10Ll)为：DNA (50ng/μl) 0.5μl、10×PCR buffer (Mg2+) 1.0μl、dNTPs (20mM) 0.2μl、primer (50ng) 0.3μl、Taq polymerase (5U/μl) 0.2μl。该程序和体系能很好地满足木薯基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记能够很好应用于木薯遗传研究。     

西瓜SRAP-PCR反应程序的建立与体系的优化

以西瓜品种中华拳王为试材,探索了西瓜SRAP-PCR反应程序,并对西瓜SRAP-PCR反应体系的各影响因子进行了梯度设置试验,筛选和建立了可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳SRAP-PCR反应程序和体系。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,50℃退火1min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。反应体系(Total为15μL):DNA 100 ng,Mg2 2.0 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,Primer 60 ng,Taqpolymerase 0.75 U。结果表明,该程序和体系能很好地满足西瓜基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于西瓜遗传研究是可行的。     

黄瓜作图亲本间分子标记的多态性分析

利用AFLP,SRAP和SSR3种不同类型的分子标记技术,研究了作图亲本F-3与HZL04-1间的多态性。结果表明,这3种标记技术多态性检测效率不同,其中,AFLP揭示作图亲本间多态性效率最高,SRAP次之,SSR多态性检测效率最低。选择高效揭示多态性的分子标记技术是提高黄瓜遗传图谱构建效率的关键。分析探讨了几种分子标记技术的优缺点,认为应用AFLP,SRAP构建黄瓜遗传图谱为最佳,SSR可以作为补充的标记。     

甘薯AFLP分子标记体系建立

AFLP是目前最常用的几种标记之一。本文以甘薯为材料,通过DNA提取、酶切、PCR扩增、凝胶电泳等系列程序摸索和优化,建立了甘薯的AFLP分子标记体系。优化的甘薯AFLP分子标记体系的程序如下:将4μl100ng/μl的甘薯DNA用EcoRⅠ酶、MseⅠ酶各5U进行双酶切,在37℃下酶切3h后再在65℃下酶切3h;然后加入10μl连接混合液在22℃下连接3h后在16℃下连接10h;取连接产物5μl,10μmol/LEcoRⅠ预扩引物和10μmol/LMseⅠ预扩引物各1.5μl,PCR缓冲液25μl,ddH2O17μl进行预扩增;取5μl稀释20倍后的预扩增产物,50ng/μlEcoRⅠ选扩引物和50ng/μlMseⅠ选扩引物各1μl,PCR缓冲液10μl,ddH2O3μl,进行选择性扩增。本研究为甘薯黑斑病和其他真菌性病害的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供了有力工具。     

辣椒SRAP-PCR反应体系的建立与优化

SRAP标记(Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)是由Li和Quiros发展了一种新的分子标记技术。SRAP标记具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特点,已经应用于在水稻、棉花、油菜、马铃薯、苹果、柑橘类果树、樱桃、梅子、大蒜、莴苣及芹菜等植物和水稻稻瘟病的研究中,对开展遗传图谱构建、基因定位与克隆、比较基因组学、cDNA指纹图谱、生物多样性研究、预测杂种优势等研究是一个十分实用的工具。本研究对辣椒SRAP反应体系的程序、模板、Mg^2 等参数进行优化研究,结果表明：辣椒的PCR程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5循环,94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,35循环,最后72℃延伸10min;25μl反应体系中,模板量为15ng,M矿为2．0mmol／L。本研究建立的辣椒SRAP体系重复性好、稳定性强。     

利用正交设计优化烟草SRAP反应体系

利用正交设计L16(45)对烟草SRAP-PCR反应体系的五因素(Taq酶,Mg2 模板DNA,dNTP,引物)在四个水平上进行优化试验,PCR结果用统计软件SPSS V13.0分析,得出如下结论:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Taq酶量影响最大;筛选出各反应因素的最佳水平,建立烟草SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶1.0 U,Mg2 1.5 mmol/L,模板DNA 30.00～120.00 ng,dNTP0.1 mmol/L,引物0.40 μmol/L.最后,应用烟草SRAP-PCR最佳反应体系对PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选,得出SRAP-PCR扩增以52℃退火温度、35个循环次数为最佳.这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对烟草进行基础研究提供了一个标准化的程序.     

水稻沈农606抗稻瘟病基因遗传分析及SRAP标记筛选

选用抗稻瘟病水稻品种沈农606为抗病亲本,以普感品种丽江新团黑谷为感病亲本配制杂交组合.对两亲本及其F2代单株进行苗期抗病鉴定,结果表明抗病亲本的抗性由核基因控制,受一对显性基因控制.根据F2代单株的抗病鉴定结果,采用BSA法,从110对SRAP引物中筛选出了4对在抗、感池间表现出多态性的引物,表明这些引物可能与沈农606的抗病基因连锁.利用这些标记对F2代112个感病单株进行扩增,根据扩增结果,采用Mapmaker 3.0软件计算遗传距离,结果显示,标记m5e1-500与抗病基因间的遗传距离最近,为2.8 cM.     

龙眼SRAP反应体系的建立和优化

采用分步优化的方法对影响龙眼SRAP-PCR反应的模板DNA用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TagDNA聚合酶用量等进行了研究。确立了适合龙眼SRAP分析的反应体系,即体系总体积25μl,包含1×PCR Buffer ,Mg2+ 2.0mmol/L,dNTPs 0.5 mmol/L,引物0.3μmol/L,模板DNA 10ng, TaqDNA聚合酶1.5 U。结果表明,该体系能很好地满足龙眼基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于龙眼遗传研究是可行的。     

日本沼虾SRAP反应体系正交设计及优化

对影响SRAP反应的4个因素(Taq酶、dNTP、Mg2+、引物)4个水平进行正交组合,以建立日本沼虾的SRAP分子标记技术。试验分两步进行:第一步筛选出可有效扩增的引物组合;第二步对筛选出的体系进行优化。结果表明,日本沼虾SRAP反应体系适宜引物组合为Me4Em2,最适条件为在25μL的反应体系中,Mg2+、dNTP、Taq酶、引物浓度分别为2.5 mmol/L、0.25 mmol/L、0.64 U/20μL、0.6μmol/L。本研究结果为SRAP分子标记技术在日本沼虾中的应用奠定了基础。     

芦笋SRAP反应体系优化及引物筛选

本研究以芦笋基因组总DNA为模板,通过对芦笋SRAP反应体系的重要参数进行优化,建立了一套适用于芦笋的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃30s、35℃30s、72℃1.5min,5个循环;然后退火温度提高到50℃,35个循环;最后72℃延伸10min。比较琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物的多态性,结果发现:6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物比琼脂糖的效果好。利用该优化体系筛选引物,从256个SRAP引物组合中筛选出239个,它们具有扩增条带清晰、丰富、重复性好的优点,证明了此优化体系稳定可靠。     

万寿菊雄性不育系SRAP-PCR体系建立与优化

本研究以万寿菊雄性不育系2-2基因组DNA为试验材料,采用单因素和L16(45)正交设计对SRAPPCR反应体系的Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物和模板DNA浓度进行优化,以得到最佳的SRAP-PCR反应体系。结果表明最佳反应体系为:20μL体系中Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 0.3 mmol/L、Taq酶0.75 U、引物0.2μmol/L、模板DNA 80 ng。应用建立的反应体系对退火温度进行优化,得到两步退火温度分别为35℃和50.2℃。最后用9个万寿菊雄性不育两用系材料组对所得PCR体系进行验证,证明该体系具有较高的稳定性和重复性,可为筛选与万寿菊雄性不育基因连锁的特异性标记奠定基础。     

SRAP标记技术及其在蔬菜作物遗传多样性分析中的应用

SRAP标记技术是基于内含子、启动子3’端含AATT核心和开放阅读框的编码区富含GC的序列规律进行随机扩增而获得DNA多态性的。由于不同的生物个体其基因组的内含子、启动子与外显子的间隔长度不同,因而扩增出的DNA指纹图谱也就产生了多态性。SRAP标记是近年来发展起来的一种DNA多态性分子标记, 以其操作简便快速、成本低、可信度高、易于测序等特点倍受关注。在短短的几年时间内,此标记已在马铃薯、水稻、苹果、柑橘类果树、樱桃、梅子、油菜、大蒜、芹菜和棉花等植物中实验应用,显示出良好的应用效果。本文综述了SRAP标记技术原理特点和在蔬菜遗传多样性研究领域初步应用情况。     

橄榄SRAP-PCR体系的建立和优化

以橄榄品种为材料,采用L16（45）的正交试验设计,对影响PCR反应的Taq酶量、Mg2+浓度、模板DNA含量、dNTPs浓度和引物浓度5个因素进行了SRAP-PCR扩增反应条件优化研究,并利用反应体系对11个橄榄品种进行了SRAP-PCR扩增。结果表明：在20μl体系中,Taq酶1.5U、Mg2+2.5 mmol/L、模板DNA 60ng、dNTPs 0.2 mmol/L和引物0.15μmol/L时的扩增效果最好;利用该体系,SRAP标记引物对Me5- Em2在11个橄榄品种中可以扩增出7条清晰的多态性条带。