木本植物叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

以2种木本植物的成熟叶片为材料,对传统的双向电泳进行改进和优化,得到1种适合于木本植物叶片蛋白质电泳分析的方法,此方法大大降低了木本植物叶片中次生代谢物质对双向电泳结果的干扰,明显改善了分析效果。     

葛枣猕猴桃叶片蛋白质双向电泳体系的研究

[目的]建立葛枣猕猴桃叶片蛋白质双向电泳体系。[方法]通过对不同的蛋白质提取方法、裂解液配方及IPG胶条的探索,建立适应于葛枣猕猴桃叶片双向电泳技术体系。[结果]TCA/丙酮法+配制裂解液较适用于葛枣猕猴桃叶片蛋白质组分析。最终可获得蛋白质点丰富、分辨率高的双向电泳图谱,可以检测出450个清晰的蛋白质点。[结论]该研究为在蛋白质组水平揭示叶片颜色变化的调控机制奠定基础。     

叶用莴苣叶片总蛋白质双向电泳影响因素的研究

以叶用莴苣叶片为试材,研究17cm固相pH梯度胶条(pH 4～7)体系下双向电泳不同的提取方法、上样体积、定量方法等影响因素,力求确定其理想的双向电泳条件。结果表明,酚-甲醇/醋酸铵沉淀法对蛋白质提取更彻底,效果更好。对于蛋白质定量的试验,相比于常规的Bradford方法,利用无干扰蛋白质定量试剂盒具有更好的准确性。考虑叶片总蛋白质中大量Rubisco的存在,应相对增加上样量,采用考马斯亮蓝染色时取800μg到1 100μg蛋白质进行双向电泳比较合理。     

黄瓜叶片细胞壁蛋白双向电泳体系的建立

【目的】建立一套适合黄瓜叶片细胞壁蛋白质组学研究的双向电泳体系,为黄瓜细胞壁蛋白质组学的后续研究奠定基础。【方法】以黄瓜品种"长春密刺"幼苗叶片为材料,比较2种不同提取介质(CaCl2和LiCl溶液)对细胞壁蛋白的提取效果,对比IPG胶条梯度、裂解液、上样量及等电聚焦程序对黄瓜叶片细胞壁蛋白双向电泳结果的影响。【结果】以0.2mol/L CaCl2和3mol/L LiCl溶液依次提取黄瓜叶片细胞壁蛋白,选用17cm pH 3~10NL IPG胶条和裂解液Ⅱ(7mol/L尿素、2mol/L硫脲、40g/L CHAPS、10g/L DTT和1mmol/L PMSF),上样量800μg,按聚焦程序Ⅰ(20℃水化14h,100V30min,250V30min,500V30min,1 000V1h,线性升压5h至10 000V,10 000V聚焦6.5h)聚焦后进行双向电泳分离和考马斯亮蓝G-250染色,可获得重复性好、分辨率高的双向电泳图谱。【结论】建立并优化了适合于黄瓜叶片细胞壁蛋白质组学分析的双向电泳体系。     

玉米叶绿体蛋白质提取及其双向电泳体系建立

为了获得纯化、完整的玉米叶绿体蛋白质,以玉米品种郑单958为试验材料,利用差速离心与蔗糖密度梯度法分离叶绿体,并对其纯度和完整度进行检测;通过光学显微镜直接观察叶绿体的形态结构并测定过氧化氢酶的活性及Hill反应速率,证明已分离出纯度较高、完整的叶绿体。随后采用2种不同的蛋白质提取方法分别提取玉米叶绿体总蛋白质,并用Bradford法进行蛋白质定量,SDS-PAGE电泳结果表明,TCA丙酮沉淀法对玉米叶绿体蛋白质的提取不充分,而TCA丙酮与酚抽提相结合法明显比TCA丙酮沉淀法效果好,提出的叶绿体蛋白质的条带数目多,丰度较高,并得到了较理想的玉米叶绿体双向电泳图。     

甘蓝型油菜根系可溶性蛋白的提取及双向电泳体系的优化

以甘蓝型油菜品种青油10号幼苗期根系为材料,采用三氯乙酸/丙酮沉淀法、酚提法及酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法分别提取甘蓝型油菜根系可溶性蛋白.以牛血清蛋白为标样,使用Bradford法测定蛋白质浓度,计算蛋白提取率,并对所提取的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)检测,所得2-DE凝胶图...     

石斛叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立及优化

以石斛叶片为材料,建立了一套适用于石斛蛋白质组分析的双向电泳体系,探讨了石斛叶片蛋白的提取、蛋白定量以及双向电泳的一些关键技术。结果表明,通过三氯乙酸(TCA)法提取、高压等电聚焦和两步平衡等方法可以获得稳定、清晰的双向电泳图谱,获得了可分辨蛋白质斑点数约613个。     

适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立

[目的]建立适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)技术,为开展番茄蛋白质组学研究奠定技术基础.[方法]对番茄叶片蛋白质提取方法、蛋白质裂解液、上样量、胶条pH范围等关键步骤进行优化.[结果]采用三氯乙酸／丙酮法提取番茄叶片总蛋白质,含有7 moL/L尿素,2 mol/L硫脲,4; CHAPS,30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解缓冲液,上样量为100 mg,以pH 4 ～7、18 cm的IPG胶条在12; SDS-PAGE凝胶浓度下进行双向电泳,得到了蛋白点均匀分布、低峰度蛋白点较为清晰,蛋白点数目多且分辨率高的2-DE图谱.[结论]建立了一套适于番茄叶片蛋白质分析的双向电泳技术体系,为下一步在蛋白组学水平上分析番茄逆境胁迫等相关蛋白提供了技术支持.     

红海榄根部总蛋白质提取方法的改进和双向电泳体系的建立

分别采用TCA-丙酮沉淀法、酚法、尿素法、周涵韬法和笔者建立的酚改良法,提取红海榄根部总蛋白质,并进行了SDS-PAGE分析和双向电泳体系的优化.结果表明,酚改良法提取红海榄根部总蛋白质的纯度最高,质量最好,为建立双向电泳分析体系提供了较为理想的蛋白样品,获得了良好的双向电泳图谱.该结果为盐生植物,尤其是盐生木本植物,建立了一套可靠的蛋白提取和双向电泳方法.     

棉花纤维蛋白双向电泳体系的建立

[目的]探索一套适合于棉花纤维蛋白的双向电泳技术,为研究棉花纤维发育的蛋白质组学奠定基础.[方法]以陆地棉徐州142为材料,比较了三种不同蛋白质提取方法以及不同裂解液组成对双向电泳的影响,并在蛋白上样量和染色方法等方面进行了探索与优化.[结果]利用饱和酚-甲醇醋酸铵法提取的棉花纤维蛋白,其蛋白含量较高,且SDS-PAGE电泳条带清晰;样品溶解于含有硫脲和CHAPS的裂解液中,其蛋白溶解度增加;不同的蛋白上样量比较结果表明,第一向等电聚焦固相pH梯度胶条(7 cm)的最适上样量为300 μg;同时,经改良后的考马斯亮蓝染-脱色后,2-D图谱的背景清晰,分辨蛋白斑点数增加.[结论]研究建立了一套适用于棉花纤维蛋白总蛋白质组分析的双向电泳方法.     

分蘖洋葱叶片总蛋白提取与双向电泳条件优化

以分蘖洋葱叶片为试验材料,比较3种不同蛋白质提取方法对2-DE蛋白质双向电泳结果的影响,并对其中的蛋白上样量、SDS-PAGE凝胶浓度及双向电泳重复性进行筛选与优化。结果表明,与酚提取法和改良的酚提取法相比,TCA-丙酮提取法提取分蘖洋葱叶片总蛋白的操作简便,所得双向电泳图谱背景清晰,蛋白质点圆滑,数量及质量均较好,是一种切实可行的提取分蘖洋葱叶片总蛋白方法。应用Image Master 2D Platinum 7.0软件对图谱进行分析,凝胶上检测到超过650多个蛋白质点,不同凝胶之间蛋白质的匹配率达92.5%,具有较高的分辨率和重复性,建立一套适用于分蘖洋葱叶片总蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)方法。     

甜瓜幼苗根系总蛋白提取方法的筛选及其电泳条件的建立

以‘西域1号,甜瓜苗期根系为材料,分别采用改进的TCA/丙酮沉淀法、Tris/酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法及SDS/酚提取法提取总蛋白,进行SDS电泳和双向电泳分离,扫描后的胶图利用Image Master 2D Elite 6.01软件进行分析,重点分析胶图总点数、匹配点数和差异蛋白点数.结果表明:Tris/酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法得到的总蛋白含量最高;TCA/丙酮沉淀法分离得到的蛋白条带和蛋白点数最少,且对分子量较高的偏碱性区域的蛋白提取效果差,与其他2种方法相比明显丢失了较多的蛋白.因此,进行甜瓜幼苗根系总蛋白质组分析时,可采用后2种方法,其中Tris/酚抽提法更简单易行.     

利用双向电泳技术分离节瓜叶片总蛋白的方法研究

【目的】建立适合节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系.【方法】以节瓜品种"A37毛节瓜"为材料,对蛋白质抽提方法、上样量、凝胶浓度及IPG胶条pH范围等关键因素进行探索与优化.【结果和结论】与TCA/丙酮沉淀法及酚提取法相比,改良酚提取法抽提蛋白质总量较高,纯度最高,SDS-PAGE电泳条带明显、清晰,双向电泳图谱蛋白质点最多、清晰均匀、纵横条纹少.利用17 cm pH 4~7范围IPG胶条、120μg蛋白质上样量、12%凝胶浓度,硝酸银染色获得蛋白质点数丰富、分辨率高、背景清晰且重复性好的双向电泳图谱,检测到节瓜叶片蛋白质点1 936个,相对分子质量主要分布于15 000~100 000之间.初步建立了一套适用于节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系,为后续开展蛋白质组学研究及其相关工作奠定了基础.     

适用于毛白杨芽双向电泳分析的蛋白质提取方法

本实验以毛白杨芽为实验材料,采用Tris鄄酚法、三氯乙酸/ 丙酮法和三氯乙酸/ 丙酮+ Tris鄄酚法对其蛋白质提 取方法进行比较,采用双向电泳分离蛋白质,通过PDQuest 软件和质谱对这3 种提取方法得到的双向电泳胶进行分 析。结果显示,三氯乙酸/ 丙酮法得到的蛋白点数量为231 ±4,得到的鲜样中的总蛋白质含量为(3.57 ±0.618) mg/ g,均高于其他两种提取方法,并且所得到的双向电泳胶更清晰,为毛白杨芽蛋白质提取的最适方法。      

水稻胚乳双向电泳技术体系的优化分析

为比较同一杂交组合不同直链淀粉含量后代在灌浆期胚乳内蛋白表达差异,文章建立了一套适合灌浆期水稻胚乳蛋白的双向电泳技术,探讨了胚乳蛋白的提取、等电聚焦上样量的选择、胶条转移等双向电泳的一些关键技术。结果表明,一次溶解蛋白样品,TCA-丙酮法优于酚法蛋白提取,300μg上样量为最适上样量,能得到清晰、分离效果好、蛋白点数较多的图像。     

双向电泳中4种常用染色方法的灵敏度比较

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,比较分析双向电泳常用4种染色方法的灵敏度,以筛选适合蛋白质组学研究所使用的染色方法。结果表明：银染GE法的灵敏度在5 ng的水平,对于BSA为0.5 ng;银染Blum法的灵敏度在10 ng的水平,对于BSA为0.1 ng;银染Schevchenko法的灵敏度在50 ng级的水平,对于BSA为5 ng;普通考染法的灵敏度在0.25μg的水平,对于BSA为0.025μg。根据结果比较,提出适合一般蛋白质组研究分析的快速灵敏的蛋白质染色方法。     

一种优化的适用于双向电泳的水稻纹枯病菌蛋白质提取方法

为开展水稻纹枯病菌蛋白质组学的研究,采用TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法对水稻纹枯病菌蛋白质提取质量进行比较,并建立了双向电泳体系。对电泳后的图谱用Quantity One软件进行分析,结果发现:TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法所获得的蛋白质双向电泳图谱中,分别记录得到557、309和877个蛋白质点。SDS法提取的蛋白质样品杂质较多,存在盐离子和小分子物质干扰,得到的蛋白点较少;TCA-丙酮法提取的蛋白质样品呈黄色,有色素残留;而在TCA-丙酮法的基础上,增加酚/SDS抽提步骤,能够有效地去除样品中的盐离子和色素等杂质,获得背景清晰、分辨率高的蛋白图谱。结果表明,本研究建立了一种优化的TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法,该法适用于水稻纹枯病菌蛋白质双向电泳的提取。     

低次烟叶蛋白质提取工艺研究

以低次烟叶为材料,研究了烟叶蛋白质最佳提取工艺。采用L9(34)正交试验设计研究了烟叶磨浆 工艺。结果表明,磨浆工艺的最佳工艺参数为固液比(烟叶:水)1:17,提取温度60℃,提取液pH 8．0,磨浆2次。 采用响应曲面分析法研究了烟叶蛋白碱溶工艺,得到其最佳工艺参数为温度60℃,pH 8．0,时间60 min,搅拌条件 下碱溶3次。烟叶蛋白酸沉操作中,在pH 3．0,4℃下静置8 h效果最佳,最终烟叶蛋白提取率为76．62％。     

锥栗果实双向电泳体系的建立

通过对传统双向电泳技术进行改进和优化,包括对锥栗果实蛋白不同提取方法的优化和不同pH值范围IPG胶条的比较等,以建立适于锥栗果实蛋白质组分析的双向电泳方法.结果表明,使用裂解液直接提取蛋白的方法所获得的双向电泳图谱稳定性和重复性较好,分辨率较高,经银染后可分辨出400多个蛋白点,其等电点主要分布于pH 4-7.