蚓激酶成熟肽的原核表达及纯化

应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因，并按相应的阅读框架克隆入表达载体pGEX-4T中谷胱甘肽S-转移酶（GST）的下游。重组质粒转化大肠杆菌Rosetta株，分别在1．0mmol／LIPTG、37℃和0．1mmol／L IPTG、28℃条件下诱导，蚓激酶成熟肽-GST融合蛋白获得了高效表达，且后者得到了可溶性蛋白。经SDS-PAGE证实所表达的融合蛋白产物相对分子量与预期的53kD相符。并且以等电点和亲和层析的方法对表达出的可溶性蛋白进行了纯化。     

鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。     

马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3．1-pIL-18为模板，采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18（IL-18）的成熟蛋白基因，通过KpnⅠ＋SacⅠ双酶切及连接反应，构建了pET32c—pIL—18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实，重组质粒中的基因片段连接正确。之后，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃、1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子质量约为33ku处出现了预期的目的蛋白。用8mol／L脲对表达产物变性，经Ni^2＋NTA柱纯化，透析复性，得到了纯化的IL-18蛋白。Western—blot分析证实，纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

鸡肌抑素基因的原核表达及蛋白纯化

利用实验室保存的重组质粒pMD18-MSTN重新构建原核表达质粒pET-32a-MSTN,将其转化到宿主茵大肠杆菌BL21上并进行诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化.结果表明:该基因在宿主菌中成功表达;目的蛋白被成功纯化,且纯度较高.     

塞内卡病毒A VP1基因原核表达及蛋白纯化

试验以猪塞内卡病毒A(SVA)VP1基因为研究对象,利用基因重组技术构建原核表达载体pET-28a(+)-VP1。重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后经1 mmol/L异丙基茁-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37益条件下诱导6 h,后经15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。结果:SVAVP1基因能在BL21(DE3)中成功表达,融合蛋白相对分子质量约36 kDa;表达的融合蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,以包涵体为主要存在形式。以上研究结果为后续SVAVP1蛋白的免疫原性的研究及塞内卡病毒病抗体ELISA方法的建立奠定了基础。     

血管内皮生长因子D基因的原核表达及纯化

利用GST融合基因表达系统原核表达血管内皮生长因子D,并进行纯化。诱导重组质粒pGEX-VEGF-D在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经超声破菌后,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,并用3C-Protease酶切去标签GST,所得产物进行15%SDS-PAGE电泳。结果表明:大肠杆菌经诱导,高效表达出分子质量约56 ku的GST-VEGF-D融合蛋白;纯化后的蛋白经酶切后电泳显示只有一条带,纯度相对较高,可基本满足生物学活性测定,为研究VEGF-D蛋白的结构和功能提供了有利的条件。     

绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2的原核表达及纯化

为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

猪脑心肌炎病毒2A蛋白的原核表达与纯化

本试验对猪脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16 ℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。     

Prokaryotic Expression and Purification of 2A Protein of Porcine Encephalomyocarditis Virus

In this study,encephalomyocarditis virus 2A protein was prokaryotic expressed and purified.E.coli was used to express foreign proteins,the EMCV 2A gene was inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a-sumo to obtain the recombinant plasmid pET28a-EMCV-2A and confirmed by PCR and sequencing.The plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3).After ultrasound fragmentation,the expression of 2A protein was mainly in the form of inclusion bodies.By optimizing the protein expression conditions,the soluble expression of the target protein could be achieved.The recombinant protein was purified by beads and identified by SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that the recombinant plasmid was successfully constructed.The molecular weight of the recombinant 2A protein was about 25 ku.The best condition was 16 ℃ with 1.0 mmol/L IPTG,about 50% of the proteins were soluble.The purified recombinant protein was double-stained by SDS-PAGE and Western blotting,and indicated that the purified protein was the recombinant protein.The study provided the basic theoretical basis for elucidating the molecular pathogenesis of EMCV and preparation of gene vaccines and antiviral drugs.     

猪细环病毒2型衣壳蛋白的原核表达及纯化

本试验通过在大肠杆菌中表达衣壳蛋白,确定最优表达条件并对其进行纯化。用PCR法扩增猪细环病毒2型（TTV2）ORF1抗原基因,定向克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得重组质粒pGEX-4T-1-ORF1。经双酶切鉴定及测序正确后转化到BL21(DE3)工程菌中,获得衣壳蛋白大肠杆菌表达株。IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定最优表达条件。重组表达质粒PCR及双酶切鉴定结果显示衣壳蛋白原核表达载体构建正确。重组融合蛋白分子质量约80 ku,主要以包涵体形式存在。37 ℃诱导5 h表达量最多,IPTG浓度对表达量无明显影响。蛋白质串联肽谱分析检测氨基酸序列与GenBank中公布的TTV2 ORF1基因序列翻译的氨基酸序列相对应,且可被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别。该融合蛋白首次用KCl染色切胶回收法对表达的融合蛋白进行纯化,纯化效果较好,性价比高。结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-ORF1重组质粒,衣壳蛋白得到了高效表达及纯化,为间接ELISA的建立及单克隆抗体的研制提供了抗原。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

LbCas12a蛋白的原核表达及活性检测

【目的】获得具有体外切割活性的来自毛螺旋菌属(Lachnospiraceae) ND2006的LbCas12a蛋白,以期为LbCas12a的应用研究提供重要的生物学工具。【方法】根据pMBP-LbCas12a质粒(Addgene, 113431)的基因序列合成LbCas12a基因,并将其与pET-28a(+)线性化载体进行同源重组,构建重组质粒pET28a-LbCas12a,经测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定后将阳性重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达。通过12%SDS-PAGE凝胶电泳检测确定IPTG诱导的最佳浓度及温度,鉴定重组蛋白的表达形式,通过Ni-NTA树脂亲和层析的方法进行纯化、超滤法浓缩,BCA法检测蛋白浓度。将浓缩后的LbCas12a与猪细小病毒(PPV)靶标DNA、CRISPR RNA (crRNA)及偶联荧光基团的非特异性单链DNA(ssDNA)探针FQ共孵育,设置1个无LbCas12a蛋白的对照组、4个不同蛋白浓度(125、250、500、1 000 nmol/L)的试验组,检测不同组别ssDNA探针的荧光强度,检测测试位点PP...     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的原核表达及纯化

本试验旨在表达并纯化鞭毛蛋白,为研究并获得高效蛋白佐剂奠定基础。用PCR扩增鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因fljB、fljB’和fliC,将扩增产物克隆至pMD19-T Simple Vector上,构建了克隆质粒pMD19-fljB、pMD19-fljB’和pMD19-fliC。克隆质粒经双酶切后将片段克隆至pET-30a中,构建原核表达质粒pET30a-fljB、pET30a-fljB’fliC和pET30a-fliC。经PCR、酶切及测序鉴定后将阳性表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达后的菌体经超声处理取上清,用Ni柱进行纯化。Western blotting证实了表达的蛋白能与豚鼠抗鞭毛蛋白血清发生特异性反应。通过优化表达条件,鞭毛蛋白fljB、fliC和fljB’fliC均以可溶性表达,纯化得到的鞭毛蛋白为后续评价其佐剂效应奠定基础。