鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因荧光定量PCR检测方法的建立

为对鸡髓样分化因子88(MyD88)、包含TIR结构域的IFN诱导连接蛋白(TRIF)和包含Toll/IL-1的接头蛋白(TIRAP)基因的进行定量检测,本研究参考鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因序列,设计并合成特异性引物,以β-actin为内参基因,建立检测对应基因的实时荧光定量PCR方法.结果表明,4个基因的扩增效率为96.7%～102%,相关系数均在0.997以上;特异性强,扩增产物均形成单一的特异性熔解峰;敏感性高,可以检测到对应基因达10-13g/mL;重复性好,变异系数均在1.5%以下.本研究所建立的荧光定量PCR方法可用于鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因表达研究.     

实时荧光定量PCR检测鸡传染性贫血病毒方法的建立

建立了Taqman实时荧光定量PCR方法检测鸡传染性贫血病毒(CAV)。选取CAV病毒的序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有CAV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×105～2.0×102个拷贝,4个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为200个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒和马立克病毒核酸都没有扩增反应。采用实时荧光定量PCR方法检测试验感染鸡的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、泄殖腔棉拭子等样品,所有检测样品都有"S"型扩增曲线,且荧光信号值高。实时定量PCR检测CAV的方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在禽病的快速检测上具有重要意义。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品.结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=1.000,具有良好的线性关系...     

实时荧光定量PCR检测布鲁菌方法的建立

旨在建立实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。经选取高度保守的具布鲁菌属特异性的BSP31基因设计了一对引物及探针,并采用矩阵法优化反应体系,筛选出引物、探针、dNTP和Mg2+最优浓度配比,同时进行了特异性和灵敏性试验,建立了实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。该方法可用于对布鲁菌病普查监测及进出境动物及其产品的检验检疫。     

TaqMan荧光定量PCR检测鸡产蛋下降综合征病毒方法的建立及应用

根据GenBank公布的鸡产蛋下降综合征病毒六邻体蛋白基因的高度保守序列,设计了2对特异性引物和1条TaqMan探针.以构建的阳性重组质粒为标准品,绘制标准曲线,建立了一种快速检测鸡产蛋下降综合征病毒的TaqMan荧光实时定量PCR方法.该方法最小检出量达10 copies·μL-1,在1.0×102～1.0×108copies· μL-1检测范围间有良好的线性关系,特异性、稳定性和重复性也较好.用建立的本方法检测感染鸡产蛋下降综合征病毒鸡群的产蛋分离物,与普通PCR相比,该荧光实时定量PCR方法具有更高的敏感性,可更好地用于鸡产蛋下降综合征病毒的临床检测.     

布鲁氏菌实时定量荧光PCR检测体系的建立及应用

本根据GenBank上公布的布鲁氏菌BCSP31基因保守区域序列设计合成一对特异性引物与TapMan探针,建立整套快速准确鉴定布鲁氏菌的实时定量荧光PCR检测体系。以实验室构建的克隆有布鲁氏菌目的片段的重组质粒为标准品,进行实时定量荧光PCR反应检测,通过优化反应条件,建立标准曲线。以标准品为模板,对该方法的特异性、敏感性与重复性进行检测与分析。并以临床样本进行检测的结果进行比较分析,结果表明,该检测体系的检测灵敏度高,重复性与特异性良好。本研究建立的实时定量荧光PCR可用于准确检测样本中的少量的布鲁氏菌,具有良好的应用前景和市场价值。     

实时荧光PCR检测鸡GAPDH基因方法的建立

根据GenBank上鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ染料建立了荧光定量PCR法.采用梯度浓度的GAPDH基因重组标准品质粒DNA进行荧光定量PCR并建立了标准曲线,经分析显示标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系;动力学曲线分析表明,在本研究所建立的反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度都达到10拷贝/反应.实时荧光定量PCR检测GAPDH基因表达水平标准品质粒和标准曲线的建立,为GAPDH基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立鸡胚致死孤儿病毒CELO的荧光定量PCR检测方法,实现该病毒在鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测.方法根据CELO L5纤突1序列设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度进行考察.运用建立的方法对40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感疫苗主种子批毒种进行CELO检测.结果:建立的荧光定量PCR其最佳线性范围为1x109~1x104拷贝/μl,R2值达0.99以上,特异性良好,与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应,灵敏度为102拷贝/μl;荧光定量PCR方法检测40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感毒种结果为阴性.结论:本研究所建立的鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法,特异性好,敏感性高,为鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测提供了技术支撑.     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法研究进展

实时荧光定量PCR技术是结合PCR技术、光谱技术和计算机技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术,其融合了PCR技术的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的特点,它不仅实现了对核酸模板的定量,而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、准确性高、自动化程度高、速度快、全封闭反应、无污染等优点,在猪瘟疫苗的定量检测、猪瘟的诊断以及猪瘟病毒强、弱毒株鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就荧光定量PCR技术及其在猪瘟诊断上的应用做一简要综述,为我国猪瘟的综合防控提供参考。     

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释质粒pMD-ORF2(含PCV2-ORF2全基因)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.000×106、0.935×105、0.987×104拷贝/μL,变异系数分别为2.527%、2.067%、2.092%。该方法的检测灵敏度与套式PCR(nPCR)相当,甚而高于常规PCR。     

Development and Preliminary Application of a Semi-nested PCR Assay for Detection of Chicken Parvovirus

In order to set up and optimize a semi-nested PCR for rapid detection of chicken parvovirus (ChPV), three specific primers were designed according to conserved sequences of NS 1 gene of ChPV. The specificity and sensitivity of ChPV semi-nested PCR were tested, and the assay was applied to detect 48 clinical samples. The specificity and sensitivity tests showed that this semi-nested PCR was only sensitive to ChPV for amplifying specific band of 186 bp and it could detect 5.62 fg/μL of ChPV DNA, without any sensitivity to other viruses, such as Newcastle disease virus, H9 subtype avian influenza virus, Marek's disease virus, infectious laryngotracheitis virus and infectious bronchitis virus. 48 chicken samples were detected and the positive rate was 16.67% (8/48). The results of our study demonstrated that the optimized semi-nested PCR could be a method that was suitable for clinical detection of ChPV.     

鸡细小病毒半巢式PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、特异、灵敏的检测鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的方法,根据ChPV的保守基因NS1设计了3条特异性引物,建立并优化了能快速检测ChPV的半巢式PCR方法,对其进行特异性和敏感性试验,并用所建立的方法对48份临床样品进行了检测。特异性和敏感性试验结果显示,建立的半巢式PCR只对ChPV敏感,扩增产物为186 bp的特异性条带;其最低能检测到5.62 fg/μL的ChPV DNA;而对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒不敏感。临床检测结果显示,同时对48份临床样品进行检测,检出率为16.67%（8/48）,提示广西区内鸡群存在ChPV感染。本研究建立的ChPV半巢式PCR方法适用于ChPV的临床检测。     

猪嵴病毒PCR检测方法的建立及其应用

本研究根据GenBank上猪嵴病毒核苷酸序列设计了一对特异性引物,建立猪嵴病毒的PCR检测方法。该方法特异性强,敏感度高,重复性好。应用该PCR方法对2010年在上海周边地区采集的116份猪粪样品进行检测,结果45份为猪嵴病毒阳性,表明上海地区猪群中猪嵴病毒相当流行。本研究建立的PCR方法可以用于猪嵴病毒的流行病学监测。     

鸡传染性贫血病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus,CAV)基因组保守区域设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种快速检测CAV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,同时验证其特异性、灵敏性和重复性.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度可达1.8×10¹拷贝/μL,远高于常规PCR方法;并与禽类其他病毒性疾病无交叉反应,具有高特异性.用分离的病毒人工感染1日龄SPF雏鸡,14日龄剖检,对感染鸡体内各器官的病毒分布及载量进行检测,结果表明,在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊和血清中均可检测到病毒,肝脏、胸腺病毒载量明显高于其他组织.本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测大量临床样品,适用于CAV的诊断与流行病学分析.     

荧光定量PCR技术在疾病检测上的应用

实时荧光定量PCR技术融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,以直接探测PCR过程中荧光信号的变化获得定量的结果。因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,成为当前疫病检测广泛采用的分子生物学诊断技术。本文就实时荧光定量PCR技术在疾病检测上的应用作一综述。     

猫传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

猫传染性鼻气管炎(FIR)病毒是引起猫传染性鼻气管炎的病原,属于猫疱疹病毒1型(FHV-1)。选择FHV-1gD基因设计1对引物FHV-1F、FHV-1R和探针FHV-1Probe,建立FHV-1实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异地检测出FHV-1的DNA,敏感性达到75fg/μL,反应效率达到107%,R²值为0.9965,Ct值的变异系数低于2%。FHV-1实时荧光定量PCR检测方法敏感性高于普通PCR,特异性好、稳定性好,适用于FHV-1的临床诊断、检测和流行病学调查。利用该方法对上海地区宠物门诊送检的疑似FHV-1感染的样品进行检测,其阳性率达到27.78％,表明上海地区宠物猫FHV-1的发病率处于较高水平。     

Establishment and Application of Quantitative Real-time PCR Detection Method for Feline Infectious Rhinotracheitis Virus

Feline herpesvirus type 1 (FHV-1) is the pathogeny of feline infectious rhinotracheitis.Based on the sequence of gD gene of FHV-1, one pair of primers(FHV-1F and FHV-1R) and FHV-1Probe were designed for the quantitative Real-time PCR detection method.The results showed that the method could detect FHV-1 DNA specifically and the sensitivity was 75 fg/μL.The reaction efficiency reached 107%, and the R² value was 0.9965.The coefficient of variance(CV) was below 2%.And the method was more sensitive than common PCR.It was specific, stable, and suitable for clinical diagnosis, detection and epidemiological investigation.Using this method, the Shanghai area pet clinic censorship suspected FHV-1 infected samples were detected, and the positive rate reached 27.78%, which indicated that the incidence of FHV-1 in Shanghai area was at a high level.     

牛副结核分枝杆菌实时荧光定量 PCR 检测方法的建立

根据GenBank上公布的牛副结核分枝杆菌C-2染色体的ISMav2基因保守区域序列设计合成1对特异性引物,建立了一套SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测牛副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)的方法。以实验室构建的牛副结核分枝杆菌pMD-ISMav2阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线,其相关系数为0.999。以构建的标准品为模板,进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法检测布氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌DNA均为阴性;最低可检测到相当于每微升1.96×10¹拷贝数的标准品阳性质粒。本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感和快速等优点,可用于牛副结核杆菌病的监测。     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。