甘南牦牛Lfcin基因克隆及序列分析

利用PCR技术从甘南牦牛基因组DNA中扩增获得了含乳铁蛋白素（lactoferricin,Lfcin）基因的DNA序列,将该DNA序列连接于pGEM-Teasy载体并测序,将甘南牦牛含Lfcin基因的DNA序列与奶牛相应序列进行比对,同时对牦牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。结果：试验首次克隆获得了含甘南牦牛乳铁蛋白（lactoferrin,LF）第二外显子的DNA序列（在Gen-Bank中获得登陆号EU247256）,共778 bp,其中LF基因第二外显子长165 bp,编码55个氨基酸,Lf-cin蛋白占25个氨基酸;序列分析结果显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛相应序列存在3个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同;各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性,Lfcin蛋白进化树符合物种进化规律。     

青海高原牦牛PRDM1基因克隆及生物信息学与差异表达分析

以青海高原牦牛淋巴结,90日龄胎儿头部皮肤,牦牛精子以及西门塔尔牛精子为材料,通过RT-PCR克隆了包含PRDM1基因编码区的cDNA序列。将克隆获得的青海高原牦牛PRDM1基因的cDNA与黄牛相应序列进行比对,对青海高原牦牛PRDM1蛋白与其他物种PRDM1蛋白进行序列比对和进化树分析,对青海高原牦牛PRDM1蛋白的特性和结构进行预测。荧光定量检测青海高原牦牛淋巴结,90日龄胎儿头部皮肤,牦牛精子以及西门塔尔牛精子中PRDM1基因mRNA表达量。结果显示,克隆获得青海高原牦牛PRDM1基因该部分cDNA片段长度为761bp,其中PRDM1基因编码区长741bp,编码246个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛cDNA序列与黄牛该序列存在3个碱基的变异;青海高原牦牛PRDM1蛋白与黄牛、野牦牛、绵羊、马相应序列同源性分别是99.0%,99.0%,97.0%,92.0%;各物种PRDM1蛋白进化树符合物种进化规律。包含卷曲螺旋等典型结构域,人甲基转移酶蛋白结构域PR蛋白1具有94%的相似性,人甲基转移酶蛋白结构域PR蛋白10具有36%的相似性,具有SET结构域活性。青海高原牦牛PRDM1基因在西门塔尔、牦牛精子中表达量极显著高于青海高原牦牛淋巴结(P<0.05),90日龄胎儿头部皮肤中表达量极显著低于青海高原牦牛淋巴结(P<0.01)。从青海高原牦牛克隆获得PRDM1基因编码区揭示了其分子特征,为青海高原牦牛PRDM1蛋白质功能的研究奠定基础。     

牦牛Hepcidin基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的普通牛Hepcidin基因序列(登录号为XM-589792.3)设计1对特异性引物.采用RT-PCR技术从牦牛肝脏组织总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列并进行测序分析,同时构建Hepcidin蛋白物种进化树.结果显示,经克隆获得牦牛Hepcidin基因322 bp的cDNA序列(GenBank登录号为EU863791),含289 bp的开放阅读框,编码82个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽;预测Hepcidin蛋白分子质量和等电点分别为8.88 ku和9.24;与已知普通牛Hep-cidin序列的同源性达99%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律.本研究为Hepcidin基因cDNA全长克隆及基因功能研究奠定了重要基础.     

牦牛Toll样受体5基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已公布牛Toll样受体5（toll-like receptors 5,TLR5）基因序列,设计全长引物,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析结果表明,克隆得到牦牛TLR5基因全长2582 bp,开放阅读框2577 bp,编码氨基酸858个,N端含有21个氨基酸组成的信号肽,分子质量为97.981 ku,理论等电点为4.85;蛋白预测结果表明,TLR5编码蛋白整体表现为亲水性;同源性分析结果表明,牦牛与野牦牛、黄牛、绵羊、山羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,说明TLR5基因序列具有较高的保守性。牦牛TLR5基因序列的成功克隆为今后深入研究牦牛及高原动物抗病及免疫机制提供非常重要的理论基础。     

牦牛Hepcidin 基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的普通牛Hepcidin基因序列(登录号为XM-589792.3)设计1对特异性引物。采用RT-PCR技术从牦牛肝脏组织总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列并进行测序分析,同时构建Hepcidin蛋白物种进化树。结果显示,经克隆获得牦牛Hepcidin基因322 bp的cDNA序列（GenBank登录号为EU863791）,含289 bp的开放阅读框,编码82个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽;预测Hepcidin蛋白分子质量和等电点分别为8.88 ku 和 9.24;与已知普通牛Hepcidin序列的同源性达 99%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。本研究为Hepcidin基因cDNA 全长克隆及基因功能研究奠定了重要基础。     

甘南牦牛线粒体DNA?Cytb基因序列分析

为深入研究线粒体DNA Cytb基因对牦牛在低氧环境适应性中的作用,本研究克隆获得甘南牦牛线粒体DNA Cytb基因全序列,并对其理化性质进行分析。获得甘南牦牛线粒体DNA Cytb基因全序列1 140 bp,编码379个氨基酸,编码产物分子质量98.5 KD,理论等电点为4.98,是亲水性的稳定蛋白,存在明显的碱基AT使用倾向性,该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。     

高原牦牛肺脏iNOS基因克隆及序列分析

为了阐明高原牦牛诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS, iNOS)在基因水平上对肺脏低氧适应的作用,试验以高原牦牛为研究对象,采用PCR扩增方法克隆了高原牦牛iNOS基因cDNA序列,并对iNOS基因的CDS序列及其编码的蛋白结构进行生物信息学分析。结果表明:高原牦牛iNOS基因的CDS序列全长为3 471 bp,共编码1 156个氨基酸;iNOS蛋白分子质量约为131.03 ku,信号肽预测显示为胞内蛋白,其氨基酸序列具有多个功能域位点,在iNOS蛋白的二级结构中,α-螺旋占37.28%、β-转角占7.27%、无规则卷曲占37.46%、延伸链占17.99%,且核苷酸序列与黄牛、马、犬、人和小鼠的同源性分别为99.45%、78.05%、85.81%、80.84%和80.73%,氨基酸序列与黄牛、马、犬、人和小鼠的同源性分别为99.57%、76.28%、84.18%、79.67%和80.54%。说明iNOS基因在进化过程中相对保守,其编码的氨基酸序列在高原牦牛与黄牛间具有较高的一致性,但与其他物种相比一致性较低。     

牦牛AQP9基因CDS全长序列克隆及其生物信息学特征分析

为了研究高原动物对青藏高原极端生境的适应机理,并为探讨高原动物适应机制提供基本数据。本研究运用基因克隆技术对牦牛脑AQP9基因CDS全长序列进行克隆,采用生物信息学方法进行分析,AQP9基因和编码序列特征进行了以下几方面的预测和分析:其物化性质、疏水性、跨膜结构和蛋白二级结构。结果表明,牦牛AQP9的CDS含有一个885bp的开放阅读框,编码295个氨基酸;牦牛AQP9基因编码蛋白分子量和理论等电点分别为31.89ku和6.21,其编码蛋白含有6次跨膜结构,属于疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠及无规则卷曲构成;牦牛AQP9基因编码氨基酸序列与黄牛、藏羚羊、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。本研究将为牦牛低氧适应性研究提供一定的基础资料。     

中国新吉细毛羊LHx2基因cDNA克隆与序列分析

以供试羊皮肤组织中提取的总RNA为模板,根据Gen Bank中登陆的绵羊LHx2基因序列设计引物,通过PCR方法扩增RT-PCR合成的LHx2基因编码区第一链c DNA,回收、纯化反应产物,将目的基因与p MD18-T载体连接、转化,获得阳性重组质粒,成功克隆新吉细毛羊LHx2基因c DNA序列,测序长为1 215 bp。基因同源性分析结果显示各物种间同源性均在80%以上。该基因编码405个氨基酸残基,蛋白同源性分析结果显示各物种间同源性差异较大;蛋白二级结构分析显示LHx2蛋白为疏水性蛋白、柔韧性较高;蛋白结构域分析结果表明克隆的基因较为完整。研究结果为深入研究新吉细毛羊LHx2基因提供理论基础。     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系.结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％、99.79％,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变(T→T→C),导致第38位氨基酸发生变化(V→V→A).牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节.     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白基因的分子克隆和进化分析

对牦牛心脏脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因进行了克隆测序，并与GenBank中9个物种相应基因编码区核苷酸序列进行了比对分析，在此基础上采用邻接法、最大简约法和最小进化法构建了牦牛与其它物种间分子系统进化树。结果表明，牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，外显子1、外显子2、外显子3和外显子4大小分别为73、173、102和54bp，内含子1、内含子2和内含子3大小分别为3460、1892和1495bp。CDS序列全长为402bp，前体氨基酸数为133个。不同物种间在该基因核苷酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99．8％、97．8％、97．0％、92．8％、88．8％、83．3％、83．1％、76．4％、68．7％。通过邻接法、最大简约法和最小进化法用H-FABP基因编码区核苷酸序列构建的物种间分子系统进化树，结果表明，3种方法构建的物种间分子系统进化树基本一致。系统树总体分为两支，斑马鱼为独立的一支，而牦牛与其它物种为另一大分支。牦牛与普通牛、绵羊与山羊先分别聚在一起，然后再聚为一类；后与猪、人依次聚为一类。小鼠和大鼠先聚为一类，再与人和其它物种聚类，然后再与鸡聚为一类。该系统聚类结果与动物学分类一致，表明H-FABP基因适合于构建不同物种间的系统进化树。     

牦牛LHB基因的分子克隆与序列分析

采用PCR法成功克隆出牦牛LHB基因的序列,在NCBI上的登录号为DQ508150。牦牛LHB基因的cds长426bp,编码141个氨基酸的产物。同源性分析,多个物种间LHB基因编码区的序列相似性在80％以上。通过牦牛与奶牛在LH的氨基酸序列上的比对发现,存在三处残基的差异,精氨酸-谷氨酰胺、甲硫氨酸-缬氨酸、苏氨酸-丙氨酸。     

中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛的性别鉴定

根据中国黑白花奶牛的ZFX、ZFY基因序列设计引物ZFY1、ZFX2、ZFY3，对中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛ZFX、ZFY基因片段进行PCR体外扩增和性别鉴定。结果显示：ZFY1、ZFX2引物对ZFX、ZFY都能扩增出一条652bp片段；ZFY基因特异性引物ZFX2、ZFY3只能对雄性扩增出一条359bp的片段；特异性引物ZFX2、ZFY3能对中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛进行性别鉴定。     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

 克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系。结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%、99.79%,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变（T→T→C）,导致第38位氨基酸发生变化（V→V→A）。牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节。     

牦牛EPOR基因编码区序列的克隆及分析

以处于不同海拔高度的3个牦牛品种即巴州牦牛、大通牦牛、九龙牦牛为研究对象,对各牦牛品种的促红细胞生成素受体(EPOR)基因编码区进行PCR扩增和克隆测序.在对测序结果进行拼接得到牦牛EPOR基因编码区全序列基础上,利用生物信息学软件对其序列进行生物信息学及比较基因组学分析.结果表明:牦牛的EPOR基因编码区全长1 527 bp,编码508个氨基酸;EPOR信号肽由25个氨基酸组成,胞外域由225个氨基酸组成,跨膜区由22个氨基酸组成,胞浆域由236个氨基酸组成;EPOR基因编码区在牦牛品种间及其与普通牛间均存在一定的差异,这些差异是否与牦牛的适应性有关,值得进一步研究.     

牦牛、犏牛、藏黄牛和普通牛HIOMT基因CDS序列的比较

褪黑激素（MLT）是调控动物季节性生殖等多种生物节律,具有复杂生理功能的一种吲哚类激素,羟基吲哚-氧-甲基转移酶（hydroxyindole-O-methyltransferase,HIOMT）是决定MLT合成波动模式的重要酶之一。采用RT-PCR法克隆并分析了牦牛、犏牛和藏黄牛HIOMT基因的CDS序列。牦牛该基因序列连续缺失123bp,通过与普通牛基因组序列比对,该缺失片断位于HIOMT基因7个外显子中的第6外显子。由于克隆所得牦牛基因组DNA相应序列未缺失上述片断,推定所获得的牦牛HIOMT基因CDS序列属可变剪接体;克隆犏牛HIOMT基因获得长、短两条件序列,长序列与藏黄牛、普通牛该序列相似,短序列与牦牛相似,但尚不能确定这两条序列各自来自父本还是母本;与普通牛HIOMT基因比较,牦牛、犏牛和藏黄牛分别有11、13（长序列17）和11个变异位点,且位于密码子第1、2位点的变异分别为4、6（7）和4个,均为非同义突变,所有非同义突变只有1处由密码子第3位变异引起,这些突变可能通过影响蛋白结构进而影响其生物学功能。还预测了牦牛、犏牛、藏黄牛和普通牛HIOMT蛋白相对分子量、理论等电点、疏水性、跨膜区等。HIOMT的保守性较强,是系统进化研究较理想的分子标记。     

牦牛FSHR基因5’端部分序列克隆及生物信息学分析

利用PCR和T—A克隆技术,测定了麦洼牦牛和杂种犏牛的FsHR基因5’端侧翼区和第1外显子的核苷酸序列,并运用BLAST、DNAMAN、Clustal等生物信息学软件与其他物种的相应序列进行了同源性比对分析,为牦牛FSHR基因结构、犏牛雄性不育、牦牛遗传多样性,以及FSHR基因与牦牛的繁殖、产肉、产奶性状相关分析提供了理论基础。结果表明：牦牛和犏牛FSHR基因5’端侧翼区长度为970bp,普通牛、羊和猪的该序列长度分别为970、973和981bp,序列长度差异较小;序列突变以碱基替换为主,牦牛与犏牛、普通牛、羊及猪的核苷酸序列一致性分别为99．4％、99．3％、98．2％、96．9％,一致性较高,为同源基因。聚类分析中牦牛与犏牛首先相聚,再依次与普通牛、羊、猪聚在一起。根据核苷酸序列推测,氨基酸组成分析显示,牦牛和犏牛的该蛋白疏水性,蛋白的亲水性和稳定性较差,为不稳定的脂溶性蛋白;二级结构主要以α螺旋和随机卷曲为主。     

牦牛FSHR基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

本研究旨在阐明牦牛促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因CDS序列及其在牦牛生殖轴中表达的特点,为探讨其在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定基础。试验采集卵泡期的牦牛与黄牛下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管及子宫组织,通过RT-PCR技术对牦牛FSHR基因cDNA进行扩增、克隆与序列分析;采用实时荧光定量PCR法检测FSHR基因在牦牛与黄牛中的组织表达差异。结果显示,牦牛FSHR基因编码区全长2 088bp,编码695个氨基酸,蛋白质分子式为C6378H10670N2088O2637S576,分子质量为177 263.85u,理论等电点(pI)为4.88,与黄牛、绵羊、山羊和猪氨基酸序列同源性较高(91.50%～99.38%)。FSHR蛋白为酸性不稳定疏水蛋白,存在信号肽与8个跨膜结构;二级结构由延伸链(15.54%)、α-螺旋(42.30%)、β-转角(1.44%)和无规则卷曲(40.72%)组成;系统进化树表明,牦牛与黄牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,FSHR基因在黄牛、牦牛检测组织中均有表达,牦牛子宫中表达量显著或极显著高于除卵巢外的其他组织(P<0.05;P<0.01),而黄牛卵巢中表达量显著或极显著高于其他组织(P<0.05;P<0.01);黄牛卵巢中表达量极显著高于牦牛(P<0.01)。说明FSHR基因在动物进化中较为保守,其在牦牛卵巢中表达量低可能影响到牦牛繁殖机能。     

三个牦牛群体DRB3.2基因PCR-RFLP多态性研究

为了研究牦牛DRB3.2基因exon 2遗传多样性,试验采用PCR-RFLP对天祝白牦牛、甘南牦牛、大通牦牛3个类群757头个体的MHC-DRB3.2基因进行PCR-RFLP分析。结果表明:共检测出8个HaeⅢ酶切位点、11种基因型;在3个牦牛类群中,HaeⅢC基因型(225 bp/175 bp/85 bp/35 bp)在大通牦牛、天祝白牦牛中是优势基因型,基因型频率分别为0.387和0.366;而在甘南牦牛中,HaeⅢA基因型(175 bp/85 bp/35 bp)为优势基因型,基因型频率为0.306。3个群体的多态信息含量分别为0.739,0.754,0.743,均达到了高度多态(PIC>0.50)。说明牦牛DRB3.2基因具有高度多态性,在研究牦牛抗病育种和提高牦牛生产性能方面具有独特的效力和广泛的应用前景。     

牦牛IL-4基因的克隆及其遗传演化关系分析

克隆牦牛白细胞介素-4（IL～4）基因,并对其进行遗传演化分析。从刀豆素（ConA）和脂多糖（LPS）联合刺激培养的牦牛外周血淋巴细胞提取总RNA．利用RT—PCR方法扩增牦牛IL-4全长cDNA,将其克隆到pMD18～T载体上,测序后进行序列分析。成功克隆到牦牛IL-4基因全序列,序列分析表明,克隆的牦牛IL-4基因序列与GenBank所登录的牛IL-4核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别这99．8％和100％,与人、猕猴、猪、山羊、马等物种的核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别在44．4％～96．3％和27．4％～91．1％之间。在国内首次成功地从牦牛外周血淋巴细胞中克隆到IL-4的基因,其ORF为408bp,推导编码135个氨基酸。