应用PCR技术检测伪狂犬病病毒

根据伪狂犬病病毒(PRV)的gE基因序列,设计并合成了一对引物,以闽A株DNA为模板,建立了检测PRV的PCR方法。该方法能从猪细小病毒闽A株和FB株中扩增出一条长度为1 808 bp的片段,对Bartha株、gE-株检测为阴性;而以猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和正常细胞的核酸为模板的均为阴性;敏感性试验表明,该体系可检测到10pg的猪细小病毒基因组DNA。表明该方法适用于检测猪伪狂犬病病毒野毒株或非gE基因缺失弱毒株。     

伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法

正ICS 11.220B 41中华人民共和国国家标准GB/T35911—20182018-02-06发布2018-09-01实施前言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国农业科学院上海兽医研究所、中华人民共和国深圳出     

PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的研究

根据编码猪伪狂犬病病毒gH基因保守序列，设计合成一对引物，通过改进病毒核酸提取方法和优化PCR反应条件，成功的从猪伪狂犬病毒感染的细胞中扩增出预期的355bp片段。而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒和正常细胞均未扩增出相应的片段，经NaeⅠ酶切鉴定，证实了该扩增片段的特异性；敏感性实验表明，该体系可检测到0．48Pg的猪伪狂犬病毒DNA。本方法的建立使猪伪狂犬病病毒的检测更为快速、简便、经济、实用。     

猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的建立与应用

参考GenBank中收录的猪伪狂犬病病毒gE基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对引物,扩增目的片段为632 bp.进行PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性及符合性试验,建立了PRV的PCR检测方法.应用该方法对临床疑似发病样品进行了检测,PRV检出率为14.6%.表明该方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于PRV的临床发病诊断及流行病学监测等.     

伪狂犬病病毒PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据伪狂犬病病毒(PRV)gp50的基因序列设计并合成引物,以我国闽A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件,建立了PRV的PCR检测方法。应用该方法对双城、Shope、Bartha等毒株的细胞培养物进行基因扩增都获得了分子量为321bp的特异性目的DNA片段,其检出敏感度为2×10~(-5)个TCID_(50)。用该方法检测人工感染仔猪的扁桃体、三叉神经节、鼻拭子、肺、脑,家兔的白细胞,小鼠的脑组织,其结果都呈现特异性阳性反应,检测狂犬病病毒,腺病毒、细小病毒皆为阴性结果。但是,应用该引物扩增马立克氏病病毒(MDV)基因,可发现一条大小约为27bp的DNA片段,表明PRV与MDV可能具有源性。本研究还建立了两种模板制备方法,即:通过煮沸裂解由细胞培养物制备DNA模板的简法,通过EDTA-胰蛋白酶消化→煮沸裂解→酚:仿:醇抽提由病料制备DNA模板的新法,为在临床上应用PRV PCR方法论断该病提供了可能。     

多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒

根据猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)3种病原体的基因保守序列，分别设计了与CSFV的E2基因、PPV的VP2基因和PRV的gⅡ基因序列互补的3对引物。用这3对引物对人为混合的样品中的PPV和PRV的DNA模板及CSFV反转录后的cDNA模板进行多重PCR扩增和多重PCR反应奈件的优化，结果同时得到3务与试验设计相符的288bp(CSFV)、575bp(PPV)700bp(PRV)特异性条带；敏感性检测结果表明，该多重PCR可以检测到14．5ng／L的CSFV、27．1pg／L的PPV、31．4ng／L的PRV的核酸模板。     

应用免疫荧光抗体技术快速检测猪伪狂犬病病毒

建立了猪伪狂犬病(pr)荧光抗体技术(FA),用该技术直接检测组织培养、实验感染和自然感染动物病料中的prv,并作了阻断试验、类症试验,证明其具有较高的特异性和敏感性。该法较常规兔体接种试验省时、省钱,可在2小时内报告试验结果。适用于prv抗原的常规检测。用该法对来自黑龙江,吉林、辽宁、内蒙、河南等省市28个猪场送检的84头份病例进行检测,阳性率为42.9％。     

猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的优化建立及初步应用

为了建立敏感性高、特异性高、重复性好的猪伪狂犬病病原的PCR检测方法,试验根据初步建立的猪伪狂犬病病毒(PRV)聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,对其PCR反应条件进行了优化,并对25个猪场210份可疑猪伪狂犬病病毒感染的病料进行了检测。结果表明:25个猪场有24个检出PR阳性,猪场检出率为96%;猪伪狂犬病病毒总体感染阳性率达60.5%(127/210),感染阳性率最高为100%,最低为0。     

猪伪狂犬病病毒套式PCR检测方法的建立与应用

对伪狂犬病病毒(PRV)国标PCR方法进行优化,建立一种高灵敏度的套式PCR方法。根据伪狂犬病病毒gD基因序列,设计并合成了2对引物,通过反应体系和条件的优化建立套式PCR方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料检测对比试验等验证建立方法的适用性。结果表明,建立的方法检测伪狂犬病病毒DNA的极限为2.6×10-7 ng/mL,灵敏度比国家标准方法提高了1 000倍,从疑似PRV感染组织病料中能大幅度提高阳性检出率。本研究成功建立了一种灵敏度高、特异性好的快速检测猪伪狂犬病病毒的套式PCR检测方法。     

猪瘟病毒猪细小病毒猪伪狂犬病病毒 PCR检测方法的建立

猪瘟、猪细小病毒感染和猪伪狂犬病是3种最为常见的、引起猪繁殖障碍的传染性疾病，在世界范围内广泛流行，给养猪业带来严重的经济损失。在兽医临床上这3种疾病有时呈混合感染，且临床表现相似，给临床诊断造成很大困难。目前对这3种疾病的确诊方法都存在着繁琐、耗时、特异性差等缺点，因而有必要建立一种特异、快速、灵敏的诊断方法用于这些疾病的临床诊断和检测。     

多重PCR检测猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究

根据GenBank上已发表的猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）的VP2基因序列和猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）的gH基因序列，设计合成了两对特异引物，分别建立了PPV和PRV的单项PCR诊断方法，通过对扩增条件的筛选，最终成功地建立了PPV和PRV的复合PCR诊断方法，即利用一次PCR反应，可同时扩增PPV的751bp和PRV355bp的特异性片段，而扩增猪圆环病毒Ⅱ型（PCV．2）及相应的培养细胞（PK-15）核酸结果均为阴性，对PPV和PRV的最低检出量分别为100Pg和10Pg的DNA。该方法适合对PPV和PRV的联合检测和鉴别诊断。     

应用聚合酶链反应检测伪狂犬病病毒DNA

选用标准的伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）闽Ａ株，经ＢＨＫ２１细胞培养，提取ＰＲＶＤＮＡ作为摸板；合成１对２０－ｍｅｒ寡核苷酸作为引物；选择扩增序列由２６２个碱基对组成的位于编码多糖蛋白ｇｐ５０基因，用耐热的Ｔａｑ－ＤＮＡ聚合酶经３０个循环以后，扩增的产物直接用凝胶电泳检测，并用标准分子量确定。结果表明：以ＰＲＶＤＮＡ作为模板进行扩增，有扩增产物生成，以同科的疱疹病毒ＤＮＡ作为模板在相同的条件下进行ＰＣＲ扩增，无扩增产物生成，说明ＰＲＶＰＣＲ扩增是特异的。ＰＣＲ技术检测ＰＲＶＤＮＡ敏感度为２８．５ｐｇ．ＰＲＶＰＣＲ技术的建立，为伪狂犬病诊断和流行病学研究提供了更敏感、可靠的手段。     

应用ELISA检测猪伪狂犬病病毒抗体

应用 ELISA 对广西八个地区25个养猪点的380头份猪血清进行了猪伪狂犬病血清学调查.结果,在六个地区检出阳性22头份,阳性率为5.3%。从而证明了广西一些地区有伪狂犬病存在.用血清中和试验(SN)与 ELISA 对抽检的24份血清作了比较。结果,SN 和 ELISA 的阳性数分别为14份(58.3%)和20份(83.3%),ELISA 的敏感性高于 SN,且快速、简便.     

伪狂犬病病毒实时荧光PCR的建立和应用

伪狂犬病是世界范围内严重影响养猪业发展的重要动物疫病,快速检测是有效防控该病的重要措施之一。为了建立该病的快速分子生物学检测方法,根据GenBank中登录的伪狂犬病病毒gD基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测伪狂犬病病毒的实时荧光PCR方法。特异性试验结果表明,该检测方法只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.42pg/μL的总DNA,与PCR方法的灵敏度对比试验表明,其敏感度比PCR至少高10倍。对同一样品进行重复性检测,在组内及组间检测的荧光扩增曲线基本重叠,证实其重复性好。对180份临床样品进行伪狂犬病病毒核酸检测,结果发现有52份阳性样品。结果表明,所建立的实时荧光PCR方法可对伪狂犬病病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点,是开展伪狂犬病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。     

伪狂犬病PCR检测方法的建立

猪伪狂犬病病毒g E基因缺失疫苗已得到世界各地养殖户的普遍认可,使用范围较广。为建立一种快速区别疫苗毒和野毒的检测方法,本试验针对PRV的g E基因序列设计引物。经过各种条件的不断摸索优化,建立了一套敏感度较高、特异性较好的反应体系,适用于临床诊断、流行病学调查及科学研究,对确诊猪伪狂犬病有重要意义。