苹果EST-SSR引物的开发及部分品种亲缘关系分析

【目的】开发苹果EST-SSR引物,评价苹果种质资源的多样性与亲缘关系。【方法】利用NCBI数据库中苹果EST的SSR位点开发了35对EST-SSR引物,建立了苹果EST-SSR体系,并利用筛选出的16对引物对苹果品种资源的亲缘关系进行研究。【结果】118份基因组DNA共扩增出等位基因位点138个,位点数的变化从3到13不等,平均每对引物检测到8.62个位点,总的多态性比率为94.2%,各引物的多态性比例分布为81.8%～100%,相似系数为0.48～1.00。利用UPGMA法构建聚类树状图,在相似性系数0.65处可将118个供试材料分为5大组:其中第1组又可分为2个亚组,包含了绝大部分供试材料;第2、3、4和5组包含的品种数目分别为12个、11个、3个和2个;第5组与其他组亲缘关系较远,相似性系数仅为0.48。【结论】筛选出的16对EST-SSR引物可用于评价苹果种质资源间的遗传多样性。     

基于EST-SSR标记分析猕猴桃种质遗传关系

利用开发的11对EST-SSR引物分析了33份猕猴桃种质资源的遗传多样性及其遗传关系。结果表明,11对EST-SSR引物在所有供试材料中均可扩增出清晰条带,其中有8对引物呈现多态性,多态性扩增率为72.7%,对33份种质材料的区分率达100%。8对多态性引物共检测到61个等位基因,每对引物可检测到的等位基因数为2-17,平均为7.6个。利用NTSYS-pc软件,以不加权成对算术平均法(UPGMA)对扩增结果进行聚类,谱系图显示,33份种质材料之间的相似系数在0.60～0.97,表明猕猴桃种质之间遗传关系相对来说不是很远。在相似系数0.73的水平上可将供试猕猴桃材料分为7个类群,其结果与传统的形态分类大体一致。从分子角度揭示了猕猴桃种质资源的遗传多态性及其遗传关系。可为猕猴桃种质改良提供理论依据。EST-SSR是非常有效和可靠的分子标记,可为猕猴桃分子育种及遗传连锁图构建奠定基础。     

天山樱桃EST-SSR引物开发及PCR反应体系优化

以新疆天山樱桃叶片为试材,从NCBI数据库中搜索天山樱桃EST序列,利用SSRHunter 1.3软件查找SSR位点,结合Primer 6.0设计引物,通过正交实验和单因素试验优化天山樱桃SSR-PCR反应体系,并用最佳体系对所开发的引物进行验证,以期为研究天山樱桃遗传多样性、构建遗传连锁图谱奠定基础。结果表明:从58对备选引物中随机挑选30对引物进行试验,有21对引物能够扩增出特异性条带,有效扩增率为70%。20μL天山樱桃SSR-PCR最佳反应体系为dNTP 0.2mmol·L~(-1)、引物0.4μmol·L~(-1)、Taq酶0.75U、模板DNA 60ng。     

EST-SSR标记在翦股颖上的通用性及遗传多样性研究

利用来自小麦、大麦、玉米、高粱、水稻的1 058 对EST-SSR 在翦股颖上进行扩增,得到有效扩增引物620 对（58.60%）。其中源于小麦、大麦、玉米、高粱、水稻的引物对数分别为313（61.49%）、30（63.83%）、101（51.53%）、11（35.48%）、165（60.00%）。进一步利用其中53 个引物对,对8 个翦股颖品种进行了遗传多样性分析。有51 对引物显示了多态性,占引物数的94.34%;共检测到368 个等位变异,平均每对引物有6.9 个等位变异;多态性信息指数（PIC）为0.49 ~ 0.93,平均为0.78;品种间遗传相似系数为0.48 ~ 0.86,平均为0.72。聚类分析结果表明,在相似系数0.75 处,8 个品种可明确的分为两大类,第Ⅰ类为高地;第Ⅱ类又可分为两个亚类,Ⅱ-1 亚类由阿尔法、潘克劳斯、回旋组成,Ⅱ-2 亚类由普特、L-93、开拓、A4 组成。     

猕猴桃性别分子标记在软枣猕猴桃中的通用性验证

【目的】猕猴桃是功能性的雌雄异株植物,在育种过程中进行实生苗早期性别鉴定研究具有重要意义。目前已有关于猕猴桃属植物早期性别鉴定分子标记开发的报道,用于特定种群实生苗童期的性别鉴定。验证这些标记在其他来源种质资源中的通用性可扩大这些标记在猕猴桃属植物中的应用范围。【方法】利用已知性别的64份软枣猕猴桃材料,采用普通PCR扩增的方法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对已报道的两组猕猴桃性别分子标记A001、A002和A003,SmX和SmY1的通用性进行检验。【结果】(1) A001和A002在软枣猕猴桃中均能扩增出多态性片段,且条带清晰明亮,但未出现性别特异片段;(2) A003的PCR扩增结果凝胶图像中,没有清晰的片段出现;(3)在对已知性别的软枣猕猴桃资源的验证试验中,SmX的扩增结果图片显示,所扩增的条带未表现出雌雄特异性,准确率很低,且条带微弱;(4) SmY1在软枣猕猴桃中能够扩增出多态性片段,但未出现性别特异的片段。【结论】在本研究所用的软枣猕猴桃种质资源中,两组标记均未表现出良好的通用性,其性别扩增结果的雌雄鉴别率很低,甚至不能扩增出清晰的片段,故不能用于本研究所用软枣猕猴桃种质资源的性别鉴定。     

油橄榄SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

设计正交试验,以油橄榄叶片DNA（CTAB法提取）为模板,对影响油橄榄SSR—PCR反应的主要影响因素进行优化,建立适合油橄榄的PcR反应和DNA多态性检测体系。试验结果表明油橄榄最佳SSR-PCR反应体系为：20μl体系中含有DNA模板20ng、dNTP0．15mmol／L、引物0．15μmmol／L、Taq酶1．0U。同时对100对引物进行扩增试验,筛选出多态性好、条带清晰的引物24对,用于油橄榄遗传多样性分析。     

南瓜MSAP 体系的优化及引物筛选

以南瓜自交系北观（Cucurbita maxima）为材料,利用正交设计L₁₆（4⁵）优化南瓜MSAP 预扩增和选择性扩增体系的主要因素。结果表明,第一步最佳酶切时间2 h,Hap Ⅱ（HpaⅡ,MspⅠ）用量0.5 μL;第二步酶切时间6 h,EcoR Ⅰ用量0.4 μL;连接体系包括酶切产物21 μL,EcoR Ⅰ接头（5 μmol · L^-1）、Hap Ⅱ接头（5 μmol · L^-1）各1.0 μL,连接时间12 h,T4 DNA Ligase 用量为0.5 μL;最佳预扩增反应体系（25 μL）包含2.0 μL 连接产物,1.5 μL 10 × PCR Buffer（Mg²⁺ plus）,2.0 μL dNTP（2.5 mmol · L^-1）,0.6 μL Taq 酶（5 U · μL^-1）,0.4 μL 上下游引物（10 μmol · L^-1）;最佳选择性扩增反应体系为预扩增产物稀释120 倍的模板4.0 μL,其他同预扩增体系。最后,利用建立好的MSAP 体系进行6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳验证并筛选出适于南瓜MSAP 分析的36 对引物,表明优化后的MSAP 体系多态性好,体系稳定,可重复,为后续进行南瓜MSAP 分析奠定了基础。     

适于甜菜遗传多样性分析的SSR引物筛选

采用CTAB法提取甜菜基因组DNA,对不同作物（甜菜、苜蓿、玉米）的SSR引物进行了筛选。每对引物都有其最适宜的退火温度（TM）,Tm的高低对扩增结果有较大影响。该实验主要通过改变PCK扩增的退火温度（当退火温度比较低时,SSR-PCR扩增的效果条带较多,特异性不好;当退火温度比较高时扩增的条带较少,而且条带也较弱,扩增效率不高）选择合适的引物。从不同作物查阅的91对SSR引物中共筛选出带纹清晰的引物7对,作为甜菜遗传多样性的SSR分析引物,为进一步进行甜菜的分子育种提供理论依据。     

高羊茅EST-SSR标记开发及遗传多样性分析

采用从其他作物转移与利用自身EST序列设计两种方法为高羊茅（Festuca arundinacea L.）开发EST-SSR分子标记,并利用所开发标记对高羊茅品种（系）进行遗传多样性分析。利用来自小麦、大麦、玉米、高粱和水稻的732对EST-SSR在高羊茅上进行通用性分析,得到406个有效的扩增引物对（55.46%）。利用高羊茅EST数据库（GenBank/dbEST）中63 853条EST序列进行微卫星序列的查找,共发现包含微卫星的EST序列420条,占整个EST总数的0.658%。其中三核苷酸基序出现频率最高（43.33%）,次之为二核苷酸基序（33.57%）。二核苷酸基序以CT/GA出现频率最高（16.90%）,三核苷酸基序以CAG/GTC出现的频率最高（10.63%）。进一步运用Primer 5.0软件设计了108个引物对,并交上海桑尼公司合成。PCR检测表明,92个引物对（85.19%）在高羊茅中均可以扩增出稳定清晰的带型。从498对（其中5种作物的406对,高羊茅的92对）有效扩增的EST-SSR引物中随机选取81对引物,对12个高羊茅品种（系）进行扩增。79个引物对显示出多态性（97.53%）。共检测到133个等位变异,平均每对引物有1.68个等位变异;多态性信息含量（PIC）值最高为0.66,最低为0.14,平均为0.48。聚类分析结果表明,12份材料在相似系数为0.61处可分为5大类：第Ⅰ类为‘爆发力’和‘法思’;第Ⅱ类为‘强劲’、‘家园’和‘翠碧A’;第Ⅲ类为‘可其思3号’和‘凌志’;第Ⅳ类为‘雅典娜2号’、‘美洲虎3号’、‘火凤凰’和‘TF160’;‘球道’单独为第Ⅴ类。     

广藿香AFLP反应体系的优化及引物筛选

以广藿香叶子为试材,采用AFLP分子标记方法,研究了广藿香AFLP反应体系,包括酶切连接体系、连接产物稀释倍数、预扩增产物稀释倍数等关键因素,并对AFLP引物组合(E/M组合)进行筛选,以期为后续的广藿香优良种质资源筛选奠定基础。结果表明:酶切体系为20μL,含300 ng模板DNA,在37℃下反应3 h;连接反应在16℃下反应12 h;连接产物的最适稀释倍数为3倍;预扩增产物的最适稀释倍数为20倍。采用优化好的反应体系筛选出了12对条带清晰、多态性丰富的引物组合。优化好的反应体系适用于广藿香AFLP分子标记研究,筛选出的引物也具有较好的多态性,可为后续的广藿香优良种质筛选提供技术支持。     

猕猴桃DNA条形码标记的筛选

以5种野生猕猴桃为试验材料,采用DNA条形码技术,对6个DNA条形码标记rbcL、matK、psbA、trnL-F、ITS、trnH-psbA进行序列分析,筛选出能鉴别猕猴桃种间分子差异的DNA条形码,以期利用DNA条形码技术用于猕猴桃育种。结果表明:通过序列碱基含量分析,trnL-F和ITS条形码序列的GC含量最高,为51.1%~55.2%,trnH-psbA的GC含量最小,约为32.0%;通过Blast比对,结果显示5个猕猴桃野生种与基因库中已登录种类的6个DNA条形码相似度在99%以上,而有些与基因库中已登录种类有所差异,体现出猕猴桃种内的遗传多样性或种间存在基因渗透;从系统进化树结果分析显示,ITS标记能将上述5个野生种明显区分,基因进化多样性两两比对分析显示,5个猕猴桃野生种之间差异明显;Tajima’s中性检验中,trnL-F,ITS和matK具有较高的核苷酸多样性和中性检验值。研究比较了6种DNA条形码标记,认为ITS种间多样性较高,差异明显,较适宜作为猕猴桃DNA条形码。     

安徽乌菜DNA提取与InDel引物筛选

利用改良的SDS法提取了153个品种的安徽乌菜DNA,并进行2次重复,均获得了较理想的DNA产物。通过试验确定了安徽乌菜InDel-PCR的10μL最佳反应体系:1×PCR Buffer 1μL,dNTP 0.2μL,引物1μL,Taq E 0.1μL,DNA 1μL,ddH2O 6.7μL;最佳PCR扩增反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火40 s,72℃延伸40 s,共36个循环,最后72℃延伸10 min,10℃保存。从供试的66对InDel引物中筛选出31对适合安徽乌菜、条带清晰、重复性高、多态性好的引物,为安徽乌菜品种鉴定、遗传多样性分析等奠定了基础。     

玫瑰SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

以玫瑰为试材,采用L16(45)正交设计和单因素试验2种方法,研究模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶5个因素对玫瑰SCoT-PCR反应体系的影响,建立最优化的反应体系并筛选合适引物。结果表明:模板DNA浓度为1.50ng/μL,Mg2+浓度为2.00mmol/L,dNTPs浓度为0.35mmol/L,引物浓度为0.70μmol/L,Taq酶用量为0.50U时,可建立玫瑰SCoT-PCR最佳反应体系,并筛选出20条扩增条带清晰、多态性丰富的SCoT引物。反应体系的优化及引物的筛选,为日后利用SCoT分子标记技术对玫瑰进行相关研究提供理论依据和技术支持。     

西瓜EST-SSR分子标记的筛选

利用国际共享获得的820条EST序列,自主设计出79对EST-SSR引物,其中有32对引物经过PCR扩增出稳定清晰的电泳条带,可以作为西瓜和相关物种的新的EST-SSR分子标记。     

中华猕猴桃矮型性状EST-SSR连锁标记的筛选

以中华猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）矮型种质‘赣猕5号’为母本,普通型中华猕猴桃‘奉雄2号’为父本构建F1群体,采用优越而高效的基于表达序列标签（Expressed Sequence Tags,EST）的简单序列重复（Simple Sequence Repeats,SSR）标记技术,结合群体分离分析法（Bulked Segregant Analysis,BSA）在荧光DNA测序仪（ABI3130）上进行了‘赣猕5号’矮型性状连锁的EST-SSR分子标记研究。结果表明,通过本实验室开发并设计的85对EST-SSR荧光引物的扩增筛选,其中引物EST-Ad042在亲本及其矮型与普通型DNA 池之间扩增出一条285 bp 的多态性片段,经对其F1代分离群体部分矮型与普通型单株的随机验证,该片段稳定出现,在矮型植株中表现为有带,在普通型植株中表现为无带。遗传连锁分析表明,该标记与矮型基因之间的连锁距离为8.8 cM。EST-SSR荧光引物能够有效地筛选到中华猕猴桃的特异标记,可以作为鉴别矮型与普通型植株的标记引物。     

铁线莲园艺品种ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

以铁线莲的园艺品种Clematis‘Gravetye Beauty’为试材,采用改良CTAB法提取其基因组DNA为模板,采用单因子试验设计,研究模板DNA含量、引物浓度、Master Mix对ISSR-PCR反应的影响,以期构建基于ISSR分子标记技术的铁线莲园艺品种遗传图谱。结果表明:25μL C.‘Gravetye Beauty’ISSR-PCR最佳反应体系的模板DNA用量5ng、引物浓度0.8μmol/L、Master Mix 12μL;利用该体系从38条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好的11条引物。     

南瓜SCoT-PCR反应体系的优化与引物筛选

为了构建适合南瓜SCoT-PCR反应的最佳体系,笔者对需要控制的5个变量使用L_(25)(5~6)正交试验设计。结果表明,最佳优化体系为:2.5 mmol·L~(-1)Mg~(2+)、0.40 mmol·L~(-1)dNTPs、0.5 U Taq酶、1.00μmol·L~(-1)引物、30 ng模板DNA,共20μL。然后从51个SCoT引物中筛选出多态性明显的引物20个,并优化最适退火温度。最后,对所得优化体系进行可行性验证。该体系有利于SCoT标记在南瓜材料上的应用,构建的优化体系及筛选出的引物可为南瓜分子遗传育种奠定基础。     

药食同源蔬菜赤苍藤SCoT分子标记体系的优化及引物筛选

笔者以24份不同来源地的野生赤苍藤种质为试验材料,采用L₉(3³)正交试验对赤苍藤SCoT-PCR反应体系进行优化,并通过优化后的体系进行引物筛选,结果表明,PCR体系中各因素对多态性结果的影响程度排序为DNA模板量>引物用量>2×Taq Master Mix用量。最佳反应体系(20μL)为1 μL DNA模板(50 ng·μL^-1)、1.2 μL引物(10 μmoL·μL^-1)、10 μL 2×Taq Master Mix和7.8 μL ddH₂O。通过该体系从36条SCoT引物中筛选出14条稳定性好、多态性高的引物,并确定了最佳退火温度。该体系的建立和引物的筛选将为后续开展赤苍藤种质资源收集与保护、遗传多样性研究和分子育种提供参考依据。