房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

同步检测动物源性成分的四重PCR的条件优化和检出限分析

为建立肉制品中牛、羊、猪、鸡动物源性成分的快速高效多重PCR检测方法,利用4对牛、羊、猪和鸡源特异性PCR引物(靶基因序列来源于线粒体基因组)对多重PCR反应条件进行优化,并确定该检测方法的检出限。结果表明:四重PCR方法最佳反应条件为牛、羊、猪、鸡源特异性引物浓度分别为0.16μmol∕L、0.40μmol∕L、0.16μmol∕L、0.16μmol∕L,退火温度58℃,退火时间45 s,循环次数40。在最佳反应条件下,所建立的牛、羊、猪和鸡4种动物源性成分四重PCR的g DNA检出限为25 pg。应用优化后的四重PCR方法对20份市售肉制品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性,结果与现行标准的检测结果一致,掺假率达45%。本试验为该4种动物源性成分的快速检测提供了技术支撑。     

节瘤拟杆菌PCR检测方法的建立

根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物，利用聚合酶链式反应（PCR）建立了一种鉴别检测该茵的方法。对可能影响PCR检测结果的一系列因素进行了较详细的研究，选择了适宜PCR检测的快捷处理病样获得反应模板的方法，对PCR反应条件进行了优化，使对已知菌株培养物检测灵敏性最高可到30个菌／30μL反应体系；用广泛的相关菌株和茵群验证引物的特异性，证明设计的引物特异性强。将PCR方法用于临床病样的初步检测，部分病样PCR检测阳性。为用PCR方法检测节瘤拟杆菌引发的牛、羊、鹿腐蹄病奠定了基础。     

AS-PCR在牛羊异种核移植上的应用

利用PCR反应延伸过程中,3′端碱基不配对,PCR反应不能启动的等位基因特异性PCR分析法(AS-PCR)原理,采用生物软件DNASTAR分析牛、羊线粒体细胞色素b(Cytb)基因,以牛、羊碱基差异较大位点作为上游引物的3′端来设计引物,进行PCR扩增反应,分析牛羊异种克隆胚中线粒体的变化情况。结果表明,AS-PCR法是一种快速、有效鉴定异种重构胚中线粒体异质性的方法。     

嵌套式PCR扩增SRY基因序列鉴定牛胚胎性别体系的建立

应用源自牛X和Y染色体同源区的1对外引物P1、P2及其各自特异区的2对内引物P3、P4和P5、P6,进行嵌套式PCR反应,对中国荷斯坦公、母牛静脉血样DNA及牛胚胎样DNA进行特异性条带的嵌套式PCR扩增,并对外、内嵌套式引物的PCR反应体系进行了优化,以准确鉴定牛早期胚胎性别.结果表明,在优化了的PCR反应体系下,中国荷斯坦公牛DNA样品得到178bp和262bp的两个条带,而母牛仅得到262bp的1个条带;静脉血样DNA性别鉴定结果与实际性别相符率为100%,表明本试验建立的体系完全可以用于牛早期的胚胎性别鉴定.     

牛肠道病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列,针对其3D基因设计合成了1对特异性引物,提取病毒RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,经条件优化,建立了BEV的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示,该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段;且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应;其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测,21份为阳性,阳性检出率为25%。     

连续多重PCR牛胚胎性别鉴定

本实验以BOV97M序列和牛的1．715卫星DNA序列设计引物进行PCR扩增，其中前者为雄性特异扩增，后者为雌雄共同扩增，以进行牛的性别鉴定。PCR扩增共进行43个循环，其中前11个循环为雄性特异扩增，在随后的33个循环中，再加入内标引物，即进行多重PCR扩增，其灵敏度可达到10pg级(约3个细胞)。     

芝麻物种特异性定性PCR方法的建立

为鉴别食品中芝麻成分的真实性,建立了一套芝麻物种特异性定性PCR方法。根据Sesamum indicum 2S albumin-like序列,设计了3对芝麻物种特异性定性PCR引物,并对引物的特异性、最适反应浓度和最适退火温度进行了筛选和优化,建立了芝麻物种特异性定性PCR检测方法。进一步对方法的灵敏度、检出限和对芝麻加工品的适用性进行了测试。结果显示,引物sesame-1F/1R的特异性最好,最优反应条件为引物浓度0.4μmol·L~(-1),退火温度60℃;该方法能够检测出芝麻质量分数为0.1%的样品,且对于芝麻油、芝麻酱2种性状的加工样品均有很好的扩增。该方法能够鉴别食品中芝麻成分,为食品质量安全监管提供了有力的技术支撑。     

牛环形泰勒虫病PCR诊断方法的建立及其应用研究

[目的]建立快速检测牛环形泰勒病的PCR诊断方法.[方法]根据牛环形泰勒虫裂殖子的表面抗原(Tams1)基因,设计一对特异性引物,以地方阳性病例提取的DNA为模板,用PCR扩增出目的条带,经克隆、测序分析后,通过优化反应体系,建立牛环形泰勒虫病的PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证试验.[结果]测序结果表明,扩增的目的片段与已知基因序列相似性为99;;该方法检测与牛的其他血液原虫无交叉反应,其最低检出限量为1.6×102 copies/μL.应用所建立的PCR检测方法对新疆吐鲁番市周边疑似地区419份牛全血进行了检测,结果阳性率为52.3; (219/419),而血液涂片检出率为43.7;(183/419).[结论]建立的牛环形泰勒虫PCR快速诊断方法具有有一定的特异性和敏感性,可用于牛环形泰勒虫病的分子诊断和流行病学调查.     

大豆TAIL-PCR反应体系的优化

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)是检测转基因作物目的基因插入位点的主要技术。为探索适宜大豆的TAIL-PCR反应体系,采用单因素试验和L16(45)正交试验对影响转基因大豆TAIL-PCR的主要参数进行分析,以期建立成熟的大豆TAIL-PCR技术体系。试验设计3个嵌套特异性引物和5种兼并引物进行了3次巢式的热不对称PCR反应。结果表明:退火温度、酶用量、模板浓度、兼并引物和较低温特异性循环在不同水平对TAIL-PCR反应结果均有影响,优化的TAIL-PCR反应体系,即第2次反应为退火温度61℃,1.0 U/30 m L Taq酶,模板浓度30 ng/μL;第3次反应为退火温度62℃,0.5 U/50m L Taq酶,模板浓度40 ng/μL,反应过程中采用降低5个较低温特异性循环,兼并引物采用AD3,在此条件下扩增的条带清晰、稳定、特异性好,适合大豆TAIL-PCR反应体系。     

应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究

通过设计特异性引物，优化Mg^2＋浓度、退火温度和循环时间等影响PCR的因素，确定了适合现场应用的PCR反应体系；46枚胚胎现场的鉴定率为87％，移植妊娠率为28％，准确率为85％，证明建立的PCR胚胎性别鉴定方法可用于生产。使用LAMP法对126枚常规胚胎和42枚性控胚胎现场鉴定，鉴定率95％，移植妊娠率33％，准确率88％，结果证明该方法可应用于牛早期胚胎性别鉴定。PCR法和LAMP法所鉴定同一样品的结果一致，说明在控制好实验条件的情况下，根据实际情况可选用这两种方法中的任何一种进行性别鉴定应用。     

昆明小鼠早期胚胎PFK基因转录产物的检测

根据小鼠肝脏型6－磷酸果糖激酶（PFK）的cDNA序列设计合成内外2对引物，以巢式RT－PCR方法检测昆明小鼠早期胚胎是否转录出PFK的mRNA。结果表明，1－细胞至桑椹期胚的mRNA均能以外引物扩增产物为模板 通过内引物扩增出1和特异目的片段，表明昆明小鼠1－、2－、4－、8－细胞至桑椹期胚胎的PFK以肝脏型的形式出现，其PFK基因已转录，糖酵解及三羧酸循环可能是早期胚胎葡萄糖代谢的主要方式。     

体外生产的牛胚胎在不同发育期的性比率

本研究旨在证实牛体外培养的雄性胚胎生长发育是否快于雌性胚胎。胚胎的性别鉴定采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术。在体外受精的第５天，胚胎根据发育期划分为三个组：１６细胞期，多于１６细胞期和桑椹期。在３个组中，雄性胚胎所占百分率分别是３２％，５３％和６３％。在体外受精的第７天，胚胎根据发育期划分为４个组：桑椹期、早期囊胚期、囊胚期和扩张囊胚期。在性别鉴定后，４个组中雄性胚胎所占百分率分别是２８％，３８％，６０％和７０％。结果表明：牛早期胚胎在体外培养条件下，雄性发育快于雌性。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究

 【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。     

牛分枝杆菌广西分离株ESAT-6基因鉴定及遗传进化分析

根据GenBank中牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）的ESAT-6基因序列（No：BX248347）设计1对引物,PCR扩增获得2株牛分枝杆菌广西分离株（mt359、mt370）,纯化产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,对经双酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序及同源性比较分析。结果表明,牛分枝杆菌广西分离株mt359、mt370与GenBank中已发表的6株毒株（5株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌）的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为100.0%,与牛分枝杆菌标准株C680001的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为96.6%。说明致病性牛分枝杆菌的ESAT-6基因十分保守,不存在种间差异。     

牛体外发育胚胎特定阶段差异表达基因研究

[目的]研究不同发育时期牛体外受精胚胎在基因表达模式上的差异。[方法]利用单个胚胎mRNA差异显示技术,对单个8细胞期胚胎与囊胚进行mRNA差异显示,获得1条特异表达条带,对其进行克隆、测序,并与GenBank进行对比。[结果]该序列与牛核糖体蛋白L31（ribosomal protein L31,RPL31）基因序列具有99%的同源性。采用实时定量PCR技术检测8细胞期和囊胚期胚胎RPL31的mRNA表达量,结果表明,RPL31在8细胞期胚胎的相对表达量为囊胚期胚胎的3.2倍。[结论]为揭示和阐明控制牛早期胚胎发育的相关机理提供依据。     

奶牛单胚RT-PCR方法的建立

单个胚胎RT-PCR法在附植前胚胎发育基因的研究中具有重要作用。选取体外培养的4细胞期胚胎,用酸性台氏液除去透明带,胚胎裂解液裂解胚胎,以单胚和多胚mRNA作模板,用锚定引物和随机引物进行RT-PCR扩增,用特异引物进行持家基因GAPDH扩增作对照,分别用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳比较单胚与多胚扩增结果,结果表明,单胚能够达到与多胚同样的结果,从单胚扩增物检出GAPDH,因此建立的单胚RT-PCR方法是有效的.     

Identification of the Sex of Earlier Embryos from Generic Hybrids of Chicken-Quail by Wpkci

In this study, a protocol was developed to identify the sex of earlier embryos of chicken （♂）-quail （♀） hybrids and successfully tested the sex proportion of each period （66-120 h）. We acquired cross bred eggs by artificial insemination, hatched them in the same batch according to the standard hatching condition of chicken, and collected earlier living embryos at 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, and 120 h randomly. We adopted RT-PCR protocol and multiple PCR, made the known sex quail as the external control, employed fl-actin as the internal control, and used primers that were designed according to conservative area of gene Wpkci of quail to identify the sex of earlier hybrid embryos. The results indicated that the primer of Wpkci can be used to identify the sex of hybrid embryos accurately; there were more male than female in earlier embryos, the sex proportion of earlier embryos compared with academic numerical value was significantly different （P〈0.01）, and there was no difference between different periods （P〉0.05）. In the present study, we concluded that a simple, fast, credible and stable protocol to identify the sex of earlier hybrids embryos had been established by using primer of Wpkci; in earlier embryos, the death rate of female was higher than that of male and there was no fluctuant peak.