用凝胶电泳法研究紫萍半叶状体衰老期间的内肽酶同工酶(摘要)(英文)

[目的]研究与紫萍半叶状体衰老相关的内肽酶及其性质。[方法]采用明胶-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析与衰老相关的内肽酶同工酶。通过改变电泳分离胶中底物蛋白浓度,可以使正染的蛋白质标准条带和负染的内肽酶条带同时显现出来,从而了解内肽酶的表征分子量。将进行电泳、复性后的聚丙烯酰胺凝胶切成相同大小的条带,分别置于含有同等浓度蛋白酶抑制剂[2mmol/L丝氨酸型内肽酶抑制剂(PMSF)、2mmol/L金属型内肽酶抑制剂(EDTA)、25μmol/L半胱氨酸型内肽酶抑制剂(E-64)]的酶反应缓冲液中进行反应,同时以不加抑制剂的胶条处理5d的样品作为对照,以分析内肽酶类型。[结果]衰老紫萍半叶状体的内肽酶同工酶谱上共出现6种内肽酶。其中,内肽酶HEP1、HEP2、HEP4和HEP6在衰老过程中出现,且活性受细胞分裂素的调控,可能是衰老相关的内肽酶。经过蛋白酶抑制剂的分析结果表明,与对照相比,E-64未能对内肽酶条带HEP1产生抑制作用,而EDTA和PMSF都能抑制内肽酶活性,且EDTA作用较明显,因此,初步鉴定分子量为120kD的HEP1为金属型内肽酶,其他3种内肽酶均为半胱氨酸型内肽酶。[结论]在紫萍半叶状体衰老早期金属型内肽酶活性较强,而在衰老后期半胱氨酸型内肽酶大量出现并具有较高的活性。     

花生种子萌发过程中子叶内肽酶活性研究

探讨花生种子在萌发过程中子叶内肽酶的活性及其同工酶数量的变化,研究金属型蛋白酶抑制剂EDTA与不同温度对内肽酶的活性的影响。采用直立玻板法萌发花生种子,运用分光光度法测定内肽酶的活力,结果发现内肽酶活力在种子萌发6 d达到最大值;运用SDS-PAGE凝胶电泳法发现在种子萌发6 d出现5条内肽酶同工酶(其中2条是金属型内肽酶);在种子萌发8 d和10 d均出现7条内肽酶同工酶(其中4条是金属型内肽酶),这些内肽酶同工酶的最适温度约为40℃,EGTA对萌发6 d时存在的2种金属型内肽酶同工酶有明显抑制作用,但并不能完全抑制其活性。     

不同光质对烟草叶片生长发育过程中类半胱氨酸蛋白酶活性及其基因表达调控的影响

[目的]探讨不同光质对烟草叶片生长发育及衰老进程中类半胱氨酸蛋白酶活性及其基因表达的调控。[方法]通过覆盖不同颜色滤膜（白膜、红膜、黄膜、蓝膜和紫膜）获得不同光质,监测不同光质下烟草叶片在生长发育及衰老过程中叶绿素含量、类半胱氨酸蛋白酶活性及相关几个基因表达的变化。[结果]与白、红、黄膜处理相比,蓝膜和紫膜处理延缓了烟草叶片生长后期叶绿素含量的下降和衰老进程,同时蓝、紫膜处理的烟草叶片有相对较低的类半胱氨酸蛋白酶活性和相关的几个基因的表达量。[结论]不同光质对烟草叶片的生长发育及衰老进程有不同的影响,这在某种程度上是通过影响类半胱氨酸蛋白酶及其相应的基因表达来实现的。     

不同光质对烟草叶片中类半胱氨酸蛋白酶基因表达和活性的影响(英文)

[目的]探讨不同光质对烟草叶片生长发育及衰老进程中类半胱氨酸蛋白酶活性及其基因表达的调控。[方法]通过覆盖不同颜色滤膜(白膜、红膜、黄膜、蓝膜和紫膜)获得不同的光质,监测不同光质下的烟草叶片在生长发育及衰老过程中叶绿素含量、类半胱氨酸蛋白酶活性及相关几个基因表达的变化。[结果]与白、红、黄膜处理相比,蓝膜和紫膜处理延缓了烟草叶片生长后期叶绿素含量的下降和衰老进程,同时蓝、紫膜处理的烟草叶片有相对较低的类半胱氨酸蛋白酶活性和相关的几个基因的表达量。[结论]不同光质对烟草叶片的生长发育及衰老进程有不同的影响,这在某种程度上是通过影响类半胱氨酸蛋白酶及其相应的基因表达来实现的。     

无核荔枝半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆及序列分析

[目的]对无核荔枝的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因进行克隆,并对其序列下进行分析。[方法]根据构建的无核荔枝胚败育SSH消减文库的半胱氨酸蛋白酶抑制剂EST序列,通过RACE技术获得半胱氨酸蛋白酶抑制基因的核苷酸序列并应用生物信息学软件进行分析。[结果]获得一个635 bp的半胱氨酸蛋白酶抑制基因序列,预测该序列含有321 bp的开放阅读框,推导其编码的蛋白质含106个氨基酸,具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂保守区,与多个物种的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因具有较高的同源性。[结论]为进一步研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物中的生理功能奠定了基础。     

百脉根半胱氨酸蛋白酶基因在根瘤衰老过程中的表达分析

为明确半胱氨酸蛋白酶与定型根瘤衰老的相关性,通过与已鉴定的紫云英半胱氨酸蛋白酶AsNODf32进行序列比对分析,从百脉根中鉴定出2个与根瘤衰老相关的蛋白酶基因LjCyp1和LjCyp5。蛋白序列及结构分析表明,LjCyp1和LjCyp5同源性高达96.2%,均含有2个典型的半胱氨酸蛋白酶结构域和液泡定位信号肽,属于木瓜蛋白酶家族。体外酶活检测显示,2个蛋白都具有半胱氨酸蛋白酶活性。通过Realtime PCR和组织化学定位分析表明,2个蛋白酶基因主要在成熟和衰老的根瘤中表达。结果表明LjCyp1和LjCyp5可能在百脉根根瘤衰老过程中发挥重要作用。     

黄瓜叶片生长期间内肽酶活性和同工酶变化及其生化特性

研究了黄瓜自然生长期间叶片可溶性蛋白质降解、内肽酶活性及其同工酶的变化,并对叶片衰老后期粗提液内肽酶的基本生化特性进行了研究.结果表明,黄瓜叶片内肽酶活性在叶片伸出5 d时较低,叶片衰老后期(叶片伸出35 d)显著升高,Rubisco蛋白发生明显降解;叶片全展以后叶片蛋白质含量与内肽酶活性显著负相关.黄瓜叶片粗提液总内肽酶的最适pH为7.0,最适温度为40 ℃,内肽酶活性可被Ca2 、Zn2 、半胱氨酸等激活.内肽酶抑制剂试验显示,丝氨酸类型的内肽酶活性占内肽酶总活性的57%左右.采用以明胶为底物的内肽酶梯度凝胶电泳活性染色方法,检测到叶片中至少有4种内肽酶同工酶,各同工酶在叶片生长过程中出现的时间和活性大小不同,丝氨酸型内肽酶同工酶活性随叶片生长明显增强,暗示该类内肽酶在黄瓜叶片衰老过程中可能具有重要作用.     

半胱氨酸蛋白酶抑制剂的系统发生分析

[目的]对已知半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码蛋白的分子量、等电点、信号肽、结构域等进行分析。[方法]在NCBI中检索半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因,下载相应的氨基酸序列。采用SMART软件预测结构域,用SingalP程序查找信号肽,用TMHMM程序搜寻预测跨膜区。多序列比对采用CLUSTALW程序。运用MEGA3.1软件,采用Neighbor-joining法构建进化树。[结果]多序列比对结果表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因存在高度保守的QxVxG基序,意味着该基序可能对半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性具有重要意义。系统进化分析可预示半胱氨酸蛋白酶抑制半胱氨酸蛋白酶活性在进化过程中可能也是保守的。[结论]该研究可为半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制半胱氨酸蛋白酶的功能研究方面提供理论参考。     

黄瓜叶片生长期间内肽酶活性和同工酶变化及其生化特性

研究了黄瓜自然生长期间叶片可溶性蛋白质降解、内肽酶活性及其同工酶的变化,并对叶片衰老后期粗提液内肽酶的基本生化特性进行了研究.结果表明,黄瓜叶片内肽酶活性在叶片伸出5 d时较低,叶片衰老后期(叶片伸出35 d)显著升高,Rubisco蛋白发生明显降解;叶片全展以后叶片蛋白质含量与内肽酶活性显著负相关.黄瓜叶片粗提液总内肽酶的最适pH为7.0,最适温度为40 ℃,内肽酶活性可被Ca2+、Zn2+、半胱氨酸等激活.内肽酶抑制剂试验显示,丝氨酸类型的内肽酶活性占内肽酶总活性的57%左右.采用以明胶为底物的内肽酶梯度凝胶电泳活性染色方法,检测到叶片中至少有4种内肽酶同工酶,各同工酶在叶片生长过程中出现的时间和活性大小不同,丝氨酸型内肽酶同工酶活性随叶片生长明显增强,暗示该类内肽酶在黄瓜叶片衰老过程中可能具有重要作用.     

小麦叶片衰老期间内肽酶同工酶的变化

以扬麦158为试验材料,采用改进的以血红蛋白为底物的梯度凝胶电泳结合内肽酶同工酶染色方法,探讨在自然衰老和暗诱导衰老条件下,叶片内肽酶(EP)活性和同工酶酶谱的变化模式。结果显示小麦叶片暗诱导衰老和自然衰老过程中,内肽酶活力均先上升后下降;在叶片暗诱导衰老过程中先后出现4种新的内肽酶同工酶,而在自然衰老过程中先后出现5种新的内肽酶同工酶,其中EP3只在自然衰老末期才能检测到。表明自然衰老与暗诱导衰老过程中的内肽酶同工酶谱变化基本相似,因此暗诱导衰老可以作为研究叶片自然衰老期间内肽酶的一种模式。     

不同磷浓度下浮萍生长和去除磷效率研究

以少根紫萍、稀脉浮萍和紫萍为供试材料,以霍格兰氏营养液为培养液,考察了夏季气象条件下3种浮萍在培养液中鲜重的增加和去除磷效率的情况。结果表明:浮萍在磷浓度为0.1~46.5 mg/L的水体中均可生长。浮萍生长的最适磷浓度范围为0.1~15.5 mg/L,其中磷浓度在3.1 mg/L左右的情况下,浮萍长势最佳。相对于稀脉浮萍和少根紫萍,紫萍表现出一定的磷去除优势,尤其是在高磷浓度条件下紫萍磷去除的优势更为明显。     

硝酸盐氮对紫背浮萍氨耐受能力的影响

为了分析硝酸盐氮对紫背浮萍氨耐受能力的影响,该文通过在4个系列氨氮培养液中加入不同水平硝酸盐氮,研究了不同情况下紫背浮萍相对生长速率、叶面积等的变化．研究结果表明,在没有硝酸盐氮的情况下,紫背浮萍的相对增长速率和叶状体大小随氨浓度增加而逐渐降低,能够耐受的最大氨质量浓度约为400mg/L[ρ(NH4^ -N)]．在硝酸盐存在情况下,紫背浮萍生长则可耐受500mg/L[ρ(NH4^ -N)],并且相同氨氮质量浓度下,硝酸盐存在使紫背浮萍相对增长速率和叶状体面积均增加．从该研究结果来看,水中硝酸盐氮的存在可提高紫背浮萍对氨的耐受性．     

猴头菇多糖的提取工艺优化及抗氧化活性研究

[目的]优化猴头菇多糖的提取工艺,并对其抗氧化活性进行研究。[方法]分别采用单因素试验与正交试验对猴头菇多糖的提取工艺进行优化,并以羟自由基清除力、过氧化氢清除力、还原力等试验对猴头菇多糖的抗氧化活性进行研究。[结果]猴头菇多糖的最佳提取工艺是提取温度85℃、液料比1∶20、提取次数3次、提取时间1.5 h/次;猴头菇多糖具有良好的羟基自由基、过氧化氢能力清除能力和一定程度的还原力。[结论]通过优化获得的猴头菇多糖水提工艺稳定可靠,糖得率高;猴头菇多糖具有一定的抗氧化活性,提示可能与其发挥其他药理作用相关。     

常见水生植物对农田退水中总氮和总磷的净化能力研究

为了解常见水生植物对农田退水中总氮(TN)和总磷(TP)的净化作用,通过模拟实验研究了空心菜、紫背浮萍、水芹菜、水浮莲、三叶浮萍和满江红对农田退水中TN和TP的净化能力.结果表明:在处理20 d后,供试水生植物对农田退水中TN的净化率达85.8％～95.6％,净化率大小顺序为:空心菜＞水芹菜＞水浮莲≈紫背浮萍＞满江红≈三叶浮萍;TP的净化率达95.3％～97.2％,净化率大小顺序为:水芹菜＞空心菜＞水浮莲＞紫背浮萍≈三叶浮萍≈满江红.而对照组仅为55.6％(TN)和58.9％(TP).这说明6种供试水生植物对农田退水中TN和TP均有较强的净化能力.     

不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响

[目的]研究不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响。[方法]以巨峰葡萄果实为材料,应用实时荧光定量PCR技术对不同处理的相对表达量进行测定。[结果]ACC氧化酶基因、ACC合成酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因表达量明显上调;脱落酸调控基因表达量明显下调。[结论]该试验为从基因水平上研究葡萄保鲜机理奠定了基础。     

北沙参水提法不同提取物体外抗肿瘤的研究

［目的］研究北沙参水提法不同提取物的体外抗肿瘤活性。［方法］采用MTT法观察北沙参水提法乙醇处理后3种不同提取物对肺癌细胞株（A549）、胃癌细胞株（SGC）、肝癌细胞株（HEP）的体外药理作用。［结果］北沙参水提后醇溶物、水提后醇沉物和水提后滤渣醇溶物的不同浓度在体外对肝癌细胞株（HEP）均具有一定的抑制作用,北沙参水提后醇溶物和水提后醇沉物各浓度间无显著差异,水提后滤渣醇溶物在300.000 μg/ml时抑制率显著高于其他浓度;对肺癌细胞株（A549）,绝大部分浓度具有一定的抑制作用,水提后醇溶物浓度为37.500μg/ml时,抑制率显著高于其他浓度,水提后醇沉物各浓度间无显著差异,水提后滤渣醇溶物浓度为75.000μg/ml和18.750μg/ml时,抑制率显著高于其他浓度 而对胃癌细胞株（SGC）,只有水提后滤渣醇溶物在300.000μg/ml时具有抑制作用,且抑制率仅为6.340%,其他均没有抑制作用。［结论］北沙参水提乙醇处理后的3种提取物对肺癌细胞株（A549）和肝癌细胞株（HEP）在体外均有一定的抑制作用,但对胃癌细胞株（SGC）几乎没有抑制作用。     

利用分子遗传标记分析浙江地区浮萍多样性

[目的]利用分子遗传标记对浙江地区的浮萍多样性进行分析。[方法]收集浙江省不同地区的6株浮萍,通过形态学特征、叶绿体基因组的rpS16内含子序列及atpF-atpH条形码序列分析浮萍的遗传多样性。[结果]形态学鉴定表明,HN-YG-3和HZ-YXY-1浮萍属紫萍属,而HZ-HZY-2、HA-LP-4、HA-HSD-5和ZS-DH-6浮萍属浮萍属。atpF-atpH序列分析表明,HZ-HSD-5浮萍和HZ-HZY-2浮萍亲缘关系最近;rpS16内含子序列分析表明,ZS-DH-6浮萍和HA-HSD-5浮萍亲缘关系最近。[结论]叶绿体基因组和atpF-atpH条形码序列分子遗传标记较形态学鉴定更能反映出浮萍遗传多样性的特点,为今后浮萍资源的开发利用提供了更多的参考依据。     

NaCl胁迫诱导小麦叶片内肽酶活力变化的研究

利用抗盐小麦品种德抗961研究了不同浓度NaCl胁迫对小麦叶片内肽酶活性、叶绿素含量及可溶性蛋白质含量的影响。结果表明,低浓度(20 mmol/L)的NaCl处理对小麦叶片中内肽酶活力、可溶性蛋白质和叶绿素含量的影响不大,而高浓度(50、100、200 mmol/L)NaCl处理可使小麦幼苗叶片中内肽酶活性升高,可溶性蛋白质含量和叶绿素含量下降。用激活剂和抑制剂处理结果表明,NaCl胁迫引起的叶片老化与叶片正常衰老一样,其过程中至少存在3种内肽酶(巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶),而在蛋白质降解中起主要作用的是巯基蛋白酶。以酪蛋白为底物时,内肽酶的最适温度为42℃,最适pH值为4.8。