农杆菌介导的苜蓿子叶节转化体系的优化

以苜蓿品种“金皇后”为试材、以苜蓿子叶节为受体,通过农杆菌介导的转化方法,研究了抑菌浓度、子叶节生理期、侵染时间、共培养时间等因素对苜蓿子叶节遗传转化的影响,进而探索最佳转化条件,为建立高效的苜蓿子叶节遗传转化体系奠定基础.结果表明:用活化的OD600为0.6左右的农杆菌菌液进行浸染时,最佳受体材料为生长9日龄的子叶节,最佳浸染时间为20 min,共培养时间为3d,头孢霉素的抑菌浓度为500 mg/L.     

甜蛋白基因MBLII 对莴苣的遗传转化

 以4 日龄莴苣(Lactua sativa L.) 无菌苗子叶为外植体, 通过根癌农杆菌介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII 对莴苣的遗传转化。抗生素浓度和子叶外植体与农杆菌的共培养时间是影响转化的重要因素。附加卡那霉素( Kan) 50 mg/ L 的诱芽培养基MS I(MS+ NAA 0. 1 mg/ L+ 6􀀁BA 0. 1 mg/ L+ 羧卞青霉素500 mg/ L) 最适于侵染后子叶外植体的诱芽培养。在外植体与农杆菌共培养0~ 7 d 的范围内, 以共培养3 d 最佳( 生芽率58. 3%, 白化率29%) 。1~ 2 cm 再生芽移入诱根培养基MS II (MS+ NAA 0. 05 mg/ L+ Kan 50 mg/ L+ 羧苄青霉素300 mg/ L) 中, 诱根率可达100%。获得的抗性植株经组织化学及PCR 特异扩增鉴定和统计, 7. 6%阳性。Southern blot 结果证明MBL II 基因已整合到莴苣基因组中。     

大白菜AB-81高频再生系统的建立及gus A基因瞬时表达的研究

 以大白菜自交系AB-81 的子叶和真叶切块为外植体, 建立了高频不定芽离体再生系统。在MS 附加TDZ 0. 2 mg/L , NAA 2. 0 mg/L , AgNO₃ 10 mg/L 和ABA 0. 25 mg/L 的再生培养基上, 子叶和真叶的不定芽再生频率分别达到93. 3%和90. 0%, 每块外植体的不定芽数达3～6 个, 最多达21 个。以EHA105/ pMOG410 为载体转化侵染大白菜AB-81 的子叶, 获得较高gus A 基因瞬时表达频率的条件为: 子叶预培养2～3 d ; 侵染的工程菌液的浓度OD 0. 3～0. 5 ; 侵染时间2～10 min ; 共培养时间2～3 d。     

根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化研究

利用带有内含子的GUS基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导的西瓜遗传转化的若干因素。结果表 明:西瓜子叶块外植体对潮霉素较为敏感,15 mg/L是适宜的筛选浓度,可明显抑制非转化组织的生长;脱菌过程中 采用500 mg/L的头孢霉素,对外植体生长影响较小;农杆菌菌株EHA105对西瓜子叶块的侵染能力较强;预培养有 利于转化;共培养3-4 d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600值为0.3的菌液侵染10min效果最 佳;共培养培养基中添加乙酰丁香酮可提高转化频率。     

萝卜遗传转化体系的建立

系统研究了影响根癌农杆菌介导的萝卜(Raphanus sativus L.)遗传转化的若干因素,建立了萝卜遗传转化体系:即切取萝卜带柄子叶外植体,先进行2 d预培养,用OD600为0.3~0.5的EHA105农杆菌菌液侵染5~7 min后,再进行5 d共培养,然后将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1的培养基上进行7 d延迟筛选,再将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1+Hyg 5 mg.L-1的培养基上进行10 d的抗性筛选。结果共获得126个抗性芽,其中8个抗性芽经PCR检测扩增出目的基因的启动子BcA9,约850bp,阳性率为6.3%,初步验证目的基因已经转入萝卜再生芽中。     

金属硫蛋白基因转化黄瓜的研究

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体,通过叶盘转化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的遗传转化体系.比较了不同苗龄,不同侵染时间对黄瓜离体再生的影响,并做了潮霉素敏感性测试.结果表明:苗龄3～4 d的子叶,侵染时间为15min,潮霉素浓度为25 mg/L最适分化出抗性小苗.最终获得3株抗性植株,经过PCR和PT-PCR检测,初步确定均为阳性转化植株.     

根癌农杆菌介导乙肝病毒表面抗原基因转化樱桃番茄体系优化

以樱桃番茄为试材,建立了樱桃番茄高频再生体系,并对农杆菌介导乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因转化樱桃番茄的条件进行了优化研究。结果表明:11d苗龄的子叶外植体在MS+6-BA 3.0mg/L+IAA 0.2mg/L的培养基上预培养2d后,用OD值为0.6的农杆菌侵染15min,可使樱桃番茄植株达到最佳的遗传转化效果。     

农杆菌介导萱草植株CHS基因的转化

以萱草‘香宝’愈伤组织为外植体,以10 d为继代周期,将携有PSN1301-CHS的农杆菌EHA105菌株侵染受体材料,使CHS基因导入到萱草‘香宝’中。建立萱草遗传转化的适宜条件:抑菌剂以浓度为350 mg/L的羧苄青霉素为宜;潮霉素为转化子的筛选剂,25 mg/L为适宜的作用浓度;转化中宜选择预培养时间为2 d;农杆菌菌液浓度OD600在0.6左右,选用重悬液为MS+3%糖;侵染时间为15 min;在菌液和共培养基中同加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养基时间为2 d。     

根癌农杆菌介导的韭菜基因转化体系的建立

 以GUS 基因为报告基因, 建立了农杆菌介导的韭菜基因转化体系。研究结果表明, 以预培养4～6 d 的根尖为转化受体, 用OD₆₀₀0. 6 ～0. 8 的LBA4404 浸染2～5 min , 共培养2 d , 然后在MS + NAA1 mg/L + BA 2 mg/L + Km 25 mg/L + Timentin 400 mg/L + As 100 mg/L 培养基上培养40 d , 后有愈伤组织产生,转入光下培养20 d 后有少量绿色不定芽产生。经X-Gluc 染色、PCR 分析和Southern blot 检验, GUS 基因已经整合到韭菜基因组染色体上。     

根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立

 在建立北海道黄杨(Euonymus japonicus 'Cu zhi')再生体系的基础上,建立其遗传转化体系,以获得转雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)基因植株。采用根癌农杆菌(Agrrobacterium tumefaciens)　( LBA4404菌株)介导法,研究影响北海道黄杨遗传转化的若干因素。结果表明,预培养与否、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等对转化频率都有一定的影响。在遗传转化过程中,不经预培养,根癌农杆菌浓度OD₆₀₀ = 0.6,侵染下胚轴40 min,再共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率。抗性植株经PCR和DNA-Southern blot检测表明,目的基因已整合到北海道黄杨基因组中。     

甘蔗遗传转化中不同阶段潮霉素抗性筛选

以新台糖22的胚性愈伤组织为材料，在诱导培养基、分化培养基及生根培养基中，分别添加不同浓度的潮霉素（Hyg）为选择性试剂。以确定甘蔗遗传转化时的最佳筛选浓度。结果表明：潮霉素对不同阶段培养基的敏感性存在一定差异，在甘蔗遗传转化时3种培养基的抗性筛选浓度分别以50、30、30mg／L为佳；在分化培养基内的毒性作用比在诱导培养基内更快、效果更好，故遗传转化时可直接将Hyg用于分化培养基进行抗性芽筛选试验。     

提高白菜离体培养植株再生频率的研究

选用 7个白菜类蔬菜栽培品种和 1个杂交亲本进行离体培养植株再生试验 ,筛选出最佳培养基配方为 1/2倍NH 4 浓度的MS培养基附加BAP 2mg/L、NAA 0 .4 5mg/L和AgNO37.5mg/L ,大幅度提高了植株的再生频率 ,高达 84 .8% ,大大缩短成苗周期 ;子叶—子叶柄接种后 ,最早的仅需 6d即可分化出不定芽 ,从接种到再生苗的移栽最快的仅需 4 0d ,平均一批约需 50d ,达到了高频快速的要求 ;该培养基对白菜类蔬菜的不同品种有着较广的适应性。对不定芽的发生过程进行组织学观察表明 ,在本试验条件下 ,白菜离体培养植株再生方式为外植体直接出芽。再生苗生根后移栽的成活率可达 95%以上。     

MAR调控的胰岛素样生长因子-Ⅰ转化甘蓝的研究

 采用根癌农杆菌介导法, 将表达框两翼构建了核基质结合区(matrix attachment region, MAR)的胰岛素样生长因子-Ⅰ ( Insulin-like Growth Factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ) 基因导入甘蓝中, 在含卡那霉素的培养基上连续4次筛选, 通过10个批次的转化试验, 获得25株抗性植株, PCR检测均呈阳性, 随机选取5株进行基因组Southern杂交, 结果有3株出现了杂交带, 表明IGF-Ⅰ基因已成功整合到甘蓝基因组中。     

根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系研究

研究建立了根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系.结果表明最佳的不定芽诱导分化和继代培养基为:MS 6-BA1.5 mg/L NAA0.2 mg/L;选择培养基中30 mg/L卡那霉素和300 mg/L的头孢霉素是适宜的抗生素使用浓度;侵染过程中0.05 MPa负压处理5 min和共培养过程中添加20 mg/L的乙酰丁香酮均可提高转化效率.卡那霉素抗性植株经2次选择继代培养后,PCR检测全部为阳性.对部分PCR阳性植株进行PGR-Southern杂交,证实外源基因已整合进入矮牵牛基因组中.     

番茄06P28子叶受体系统建立的研究

以番茄06P28为试材,对其子叶分化培养基及该材料对潮霉素和羧苄青霉素的天然耐性进行了研究.结果表明:适宜的分化培养基为MS 6-BA 2.0 mg/L IAA 0.2 mg/L,潮霉素的筛选浓度和羧苄青霉素的抑菌浓度分别以10mg/L、35mg/L为宜.     

籽瓜的子叶外植体切块组培成株研究

以新籽瓜2号等籽瓜(Citrullus Lanatus ssp.vulgaris convar.megalaspermus Lin et Chao.)品种为材料,进行了子叶外植体切块组培中成苗因子的研究。结果表明,幼苗子叶是籽瓜组织培养的适宜外植体。MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA培养基是子叶不定芽诱导的适宜培养基,芽伸长培养基以MS+0.2mg/L KT为宜。MS+0.5mg/L IAA是诱导生根的最佳培养基。试验初步建立了适用于籽瓜遗传转化的子叶快速高频再生系统。     

4x菜薹与4x芥蓝种间杂交获得异源四倍体及其鉴定

 以四倍体菜薹（2n=4x=40）为母本与四倍体芥蓝（2n=4x=36）进行种间杂交，通过子房培养，获得了菜薹与芥蓝的异源四倍体种间杂种。研究表明，适宜菜薹与芥蓝种间杂交子房培养的培养基为Nitsch培养基，附加蔗糖70 g/L，琼脂7 g/L，维生素B₁ 0.5 mg/L，维生素B₆ 0.5mg/L，生物素0.01 mg/L，6-BA 0.5 mg/L，IAA 0.1 mg/L，pH 5.8；适宜培养的取材时间为授粉后7 d；细胞学鉴定和流式细胞仪分析表明，该杂种的染色体数为2n=4x=38，DNA相对含量约为其二倍体亲本的2倍；该杂种的开花期，叶形、叶色、花冠大小和花色等特征介于两个亲本之间。     

卷丹转基因体系构建及岷江百合LrCCoAOMT的导入

以卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）无菌小鳞片为试材,通过切片处理、优化农杆菌侵染浓度与时间以及重悬液和共培养基成分,构建农杆菌介导的高效遗传转化体系。结果表明,MS + 1.5 mg ? L-1 6-BA + 0.5 mg ? L-1 NAA + 30 g ? L-1蔗糖是切片芽分化的最佳培养基,添加100 mg ? L-1抗坏血酸能有效抑制褐化并促进不定芽增殖。MS + 2.0 mg ? L-1 NAA + 30 g ? L-1蔗糖是生根诱导的最佳培养基。抗生素敏感性测试发现,培养基中添加Kan 100 mg ? L-1或Hyg 75 mg ? L-1 结合Cef 400 mg ? L-1适宜抗性筛选。GUS染色分析表明,以去除大量元素的改良MS + 100 μmol ? L-1 AS和去除大量元素的改良MS + 1.0 mg ? L-1 6-BA + 1.0 mg ? L-1 NAA + 100 μmol ? L-1 AS为重悬液和共培养基,将切片在农杆菌菌液浓度OD600为0.4,侵染15 min,获得81.72% 瞬时转化率和25.2% 稳定遗传转化率。将岷江百合LrCCoAOMT转化卷丹,分子检测和GUS染色分析表明已获得转基因阳性株系。