苜蓿根瘤菌cfp荧光标记株的构建及筛选方法

荧光标记根瘤菌在研究根瘤菌侵染宿主形成结瘤时具有良好的示踪效果。本研究以辅助菌株Escherichia coli pRK2073,受体菌苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 12531和苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti GN5,及cfp青色荧光基因供体菌E.coli pMP45179为供试菌株,以三亲本杂交法进行结合转导,并以无氮培养基和TY培养基对标记菌株进行荧光表达及固氮特性的遗传稳定性检测,再对初选菌株以甘农5号紫花苜蓿为宿主进行回接验证,测定了回接植株的生物量,结瘤数和标记菌的占瘤率等指标。结果表明,1)三亲本杂交转导法适用于苜蓿根瘤菌cfp标记菌株的构建,获得大量S.meliloti 12531和R.meliloti GN5的荧光标记株;2)经逐层筛选获得的荧光标记菌中,S.meliloti 12531-cfp6和R.meliloti GNf-cfp5遗传稳定性好,荧光表达量高,结瘤促生能力强;3)与现有抗生素平板分离筛选相比,无氮培养基结合耐药平板筛选能显著提高荧光标记根瘤菌株的甄别筛选效率;4)三亲本杂交法获得的苜蓿根瘤菌荧光标记株个体间差异较大,对标记株固氮及荧光表达能力遗传稳定性的验证和对宿主植物的结瘤促生能力的检测是cfp荧光标记根瘤菌筛选的必要手段。     

LaCl_3、IAA及植物体液对荧光标记根瘤菌生长和增殖的影响

以标记根瘤菌及其原始菌株为试验材料,研究LaCl3、IAA及植物体液对荧光标记根瘤菌生长和增殖的影响。分别将荧光标记根瘤菌Sinorhizobium meliloti.12531f、Rhizobium meililoti.GNf及其原始菌株Sinorhizobium meliloti.12531、Rhizobium meliloti.GN5接种于含50mg/L LaCl3溶液、0.08mg/L IAA溶液及甘农5号苜蓿植株体液的YMA固体及液体培养基中,于22h及46h后测定各培养基上的菌落直径或D600nm值,以此判断植物体液对荧光标记根瘤菌及其原菌株生长和增殖的影响。结果表明,标记根瘤菌及其原始菌株在含几种外源物质的培养基上均能正常生长并增殖,且外源物质对各菌株的生长有不同程度的促进作用。培养22h时,R.GNf、S.12531及R.GN5在含几种外源物质的固体培养基上增殖速度较快,R.GN5在不同物质处理下生长速度最快,为对照的233%～250%;苜蓿植株体液较其他3种物质更能促进菌株的生长和增殖。     

接种红色荧光蛋白标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长及结瘤能力的影响

将含有红色荧光蛋白(RFP)基因质粒的荧光标记根瘤菌S.LZgn5-rfp2,S.12531-rfp4、S.LH343-rfp3接种于甘农5号和WL343HQ紫花苜蓿,分别测定2个苜蓿品种幼苗的生物量、生长指标、固氮酶活性等指标。结果表明:RFP标记根瘤菌与出发菌相比对苜蓿幼苗生长无显著影响,与不接菌的苜蓿幼苗相比有明显的促生效果,能稳定的在苜蓿幼苗体内表达,并具有与出发菌无差异的促生能力,2个苜蓿品种间也无特异性。     

硼对苜蓿根瘤菌(Ensifer meliloti)形态和代谢产物含量的影响

以Ensifer meliloti LZgn5(苜蓿内源根瘤菌)和E.meliloti 12531(苜蓿外源根瘤菌)作为研究对象,研究硼对内源和外源根瘤菌生长、胞外多糖和生长素(IAA)产量、固氮酶活性以及菌体形态结构的影响。试验共设5个处理,未加硼的菌液为对照组、gn5f和gn5o(100mg/L硼处理荧光蛋白标记和非标记E.meliloti LZgn5)以及12531f和12531o(1mg/L硼处理荧光蛋白标记和非标记E.meliloti 12531f)。结果表明,100mg/L硼处理gn5f和gn5o以及1mg/L硼处理12531f和12531o,均可促进相应根瘤菌的生长、胞外多糖及IAA产量,同时可以改变菌体形态及表面结构,但对固氮酶活性无影响。为硼促进内源和外源根瘤菌在紫花苜蓿体内运移、定殖机理研究提供间接依据。     

接种荧光标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长的影响

将含有cfp(cyan fluorescent protein)基因质粒的荧光标记根瘤菌S.LZgn5-cfp6、S.LZgn5-cfp16、S.LZgn5-cfp28,S.12531-cfp2、S.12531-cfp13、S.12531-cfp26、S.LH3436-cfp1、S.LH3436-cfp2、S.LH3436-cfp6接种于甘农5号紫花苜蓿,测定苜蓿幼苗生物量、单株结瘤数、固氮酶活性等,结果表明:荧光标记根瘤菌可有效促进植株生长和生物量的积累,有明显促生效果;与出发菌相比,荧光标记根瘤菌未对苜蓿幼苗产生显著的不良影响,能在植物体内稳定表达,具有与出发菌株相近的促生能力。     

硼处理根瘤菌接种液对紫花苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量的影响

以甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa'G a n n o n g N o.5')为材料,设置未添加硼且未接菌的紫花苜蓿为对照和添加不同硼浓度(0、0.05、1、5、10和100 mg·L?1)的两种根瘤菌菌液(Sinorhizobium meliloti LZgn5f和S.meliloti 12531f)接种紫花苜蓿幼苗根部,研究硼处理根瘤菌接种对不同时期根、茎、叶中可溶性糖含量的影响.结果表明:1 mg·L?1硼处理外源根瘤菌12531f和100 mg·L?1硼处理内源根瘤菌gn5f接种后,不同取样时期苜蓿根和茎中可溶性糖含量均高出对照和单独接菌处理,且可以促进不同时期苜蓿体内可溶性糖向根和茎中运输积累.综上所述,适宜的硼处理两菌株均可促进不同生长时期叶中可溶性糖向根和茎中运输积累,保持根、茎、叶中可溶性糖的动态平衡.     

硼处理根瘤菌接种液对紫花苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量的影响

以甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa ‘Gannong No.5’)为材料,设置未添加硼且未接菌的紫花苜蓿为对照和添加不同硼浓度(0、0.05、1、5、10和100 mg·L~(-1))的两种根瘤菌菌液(Sinorhizobium meliloti LZgn5f和S. meliloti 12531f)接种紫花苜蓿幼苗根部,研究硼处理根瘤菌接种对不同时期根、茎、叶中可溶性糖含量的影响。结果表明:1 mg·L~(-1)硼处理外源根瘤菌12531f和100 mg·L~(-1)硼处理内源根瘤菌gn5f接种后,不同取样时期苜蓿根和茎中可溶性糖含量均高出对照和单独接菌处理,且可以促进不同时期苜蓿体内可溶性糖向根和茎中运输积累。综上所述,适宜的硼处理两菌株均可促进不同生长时期叶中可溶性糖向根和茎中运输积累,保持根、茎、叶中可溶性糖的动态平衡。     

硼对根瘤菌在紫花苜蓿体内运移和定殖及对幼苗生长的影响

通过向青色荧光蛋白(CFP)标记的两种根瘤菌菌液Ensifer meliloti LZgn5f (gn5f) 和Ensifer meliloti 12531f (12531f)内添加不同浓度硼并接种于苜蓿幼苗根部,研究硼对荧光标记根瘤菌在甘农5号紫花苜蓿幼苗体内运移和定殖的动态变化及接种对苜蓿幼苗生长的影响。结果表明,添加1 mg/L硼较利于12531f生长, 100 mg/L硼较利于gn5f生长。添加适宜浓度硼对苜蓿幼苗体内荧光标记根瘤菌运移和定殖具有促进作用,两种荧光标记根瘤菌在根部定殖数量较多,其中添加100 mg/L硼15 d时根部12531f数量最高,达2184.99 cfu/g,添加0.5 mg/L硼60 d时gn5f数量最高,达58307.11 cfu/g;同时可向地上运移,主要运移并定殖于下部茎叶内,1 mg/L硼利于12531f在下部茎叶内定殖,100 mg/L硼利于gn5f在下部茎内定殖。对照各部位未检测到两种荧光标记根瘤菌。添加硼处理的单株结瘤数、单株根瘤重、单株叶片数、株高、根长、地上鲜重、地上干重、根鲜重和根干重均高出对照和单独接菌处理,1 mg/L硼+12531f处理高出对照和单独接菌处理,范围在21.31%~909.28%之间;100 mg/L硼+gn5f处理高出对照和单独接菌处理,范围在15.07%~1424.24%之间;虽然单独接种12531f抑制了叶绿素的形成,但添加1 mg/L硼后其含量则升高,分别显著高出对照和单独接菌处理18.31%和36.86%(P<0.05),而接种gn5f则促进了叶绿素的合成,添加100 mg/L硼后含量分别显著高出对照和单独接种处理24.41%和12.92%(P<0.05)。因此,1 mg/L硼与12531f混合接种,100 mg/L硼与gn5f混合接种对根瘤菌在苜蓿幼苗体内运移和定殖及对幼苗的生长具有促进作用,为苜蓿种植提供了依据。     

几种外源物质对内生根瘤菌侵染苜蓿芽苗并在植株体内运移的影响

内生根瘤菌普遍存在于豆科植物的种子及植株体内,但其在苜蓿体内的运移通道、运移规律及运移的影响因素尚不明确。本研究用菌液中分别混合3-吲哚乙酸、LaCl₃和其他根瘤菌的胞外聚合物(EPS)(过滤除去活菌菌体)对‘甘农5号’紫花苜蓿(Medicago sativa ‘Gan Nong 5’)芽苗浸根处理,比较青色荧光蛋白(CFP, cyan fluorescent protein)标记根瘤菌在芽苗体内的运移动态及数量分布,探明内源根瘤菌(分离自宿主植株根瘤)与外源根瘤菌(购自中科院菌种保存中心)在宿主体内的运移差异。结果表明:胞外聚合物使Rhizobium meliloti.GNf (内源标记菌)在芽苗根和茎内的数量为对照(未添加外源物质的菌液处理)的11.43和1.71倍。50 mg·L^-1的LaCl₃使根内R.meliloti GNf和S.meliloti 12531f(外源标记菌)的菌体增加656.83%和303.19%,且使S.12531f在茎内的菌体仅为对照的3.64%。IAA处理使芽苗根内R.GNf和S.12531菌体增加18.34和12.11倍,使茎中S.12531增加163.09%,但R.GNf降低为对照的75.45%。IAA处理能降低芽苗子叶内R.GNf数量至对照的4.13%,表明三种外源物均能增加标记菌在芽苗根系中的数量。无外源物时,标记菌在芽苗各部位的数量差异表明,根瘤菌由根系向茎和子叶的运移通道存在仅允许内源菌通过的选择性屏障。     

磁化水处理对苜蓿根瘤菌生长和结瘤固氮的影响

为明确磁化水对根瘤菌生长及结瘤固氮的作用,测定在2万Gs恒定磁场下处理的磁化水对苜蓿根瘤菌生长及其结瘤固氮的影响.结果表明:不同磁化次数的磁化水均能显著影响XGL026菌株生长,降低OD值,磁化水培养基中的活菌数为普通培养基的86.96%～65.72%,菌数降低幅度随磁化次数增加而增大,磁化3次以上的磁化水对活菌数的降低效应极为显著(P<0.01).在盆栽苜蓿上接种绿色荧光蛋白基因(GFP)标记菌株XGL026-GFP,采用磁化水灌溉对根瘤菌在根际土壤中的存活和定殖具有抑制作用,苜蓿单株结瘤数与普通水对照相比平均减少46.4%(P<0.01).磁化水处理的苜蓿地上、地下部分的固氮率分别降低21.06%和20.48%,固氮量分别降低26.64%和37.5%,植株干物质重分别减少27.62%和13.46%.表明磁化水处理对苜蓿根瘤菌的生长、定殖和固氮及植株干物质重均有抑制作用.     

磷酸二氢钾对苜蓿幼苗体内根瘤菌运移及定殖的影响

试验以WL343HQ紫花苜蓿(Medicago sativacv.WL343HQ)及3株青色荧光蛋白(CFP)标记根瘤菌株Rzhizobium LH3436f(3436f)、Ensifermeliloti 12531f(12531f)和Rzhizobium GN5f(gn5f)为材料,添加不同浓度磷酸二氢钾(KH2PO4)于3株标记根瘤菌菌液内,分别筛选出3个有利于各标记根瘤菌生长的KH2PO4浓度,并分别将选定浓度的KH2PO4与相应的标记根瘤菌组合接种于苜蓿幼苗根部。检测根瘤菌侵入根系后在苜蓿幼苗体内运移及定殖的动态变化和对苜蓿幼苗生长的影响,探讨KH2PO4促进根瘤菌运移和定殖的适宜浓度及根瘤菌运移和定殖的效果。结果表明:50mg/L KH2PO4促使3436f长期稳定的大量定殖于苜蓿根系,定殖数量最高达到27075.12cfu/g,显著高于其他处理(P0.05),并快速运移至上部茎和上部叶中,数量分别为19.20cfu/g、9.94cfu/g;50mg/L KH2PO4促使12531f大量定殖于根系,也可运移至上部茎,数量为53.45cfu/g;200mg/L KH2PO4促使gn5f稳定定殖于根系和茎内,接种45d时下部茎内仍有定殖,数量为33.29cfu/g。添加KH2PO4接种可明显提高苜蓿单株结瘤数和单株根瘤重,增加苜蓿叶片数、株高、根长、地上鲜重和根鲜重,显著促进了标记根瘤菌侵染根系并进入苜蓿体内运移和定殖。结合苜蓿体内根瘤菌运移和定殖以及苜蓿生长各指标优化状况,筛选出标记根瘤菌株与KH2PO4的优良组合为3436f+50 mg/L KH2PO4,12531f+50 mg/L KH2PO4和gn5f+200mg/L KH2PO4,为苜蓿接种目标根瘤菌并促使其在体内运移和定殖至种子,构建目标根瘤菌与苜蓿良种种子共生体奠定基础。     

耐重金属苜蓿中华根瘤菌的筛选及其与能源植物联合富集铜的特性

为了提高能源植物在重金属矿区废弃地边际土壤上的适应性,研发根瘤菌-能源植物联合修复技术,从生长于铜矿废弃地土壤上的紫花苜蓿根瘤中分离纯化根瘤菌,并研究其对紫花苜蓿、多年生黑麦草和甜高粱等能源植物生长和富集铜的作用,探究根瘤菌对铜矿废弃地土壤改良的效应。结果表明,从紫花苜蓿根瘤中分离筛选到一株耐铜铅镉的苜蓿中华根瘤菌D10。在铜矿废弃地土壤上,甜高粱的生物量可达黑麦草的4.6～6.4倍。与接灭菌液对照相比,D10菌株能够促进紫花苜蓿和甜高粱的干重显著增加28.6%～78.1%,铜吸收量显著增加50.4%～111.8%。但D10菌株不能促进黑麦草的生长和Cu吸收。D10菌株能够促进甜高粱和紫花苜蓿生长和Cu富集,增加根际土壤有效态Cu含量、水溶性糖含量和土壤脲酶活性,具有应用于铜矿废弃地植被恢复和联合修复污染土壤的潜力。     

贮藏方法对紫花苜蓿种子内生根瘤菌定殖的影响

为探索贮藏方法对紫花苜蓿种子内生根瘤菌定殖的影响,将甘农5号紫花苜蓿在结荚期用3种根部接种方法(主根微破损浇灌、根部浇灌、添加苦参碱浇灌)接种两种荧光标记根瘤菌Ensifer meliloti LZgn5f(gn5f)和Ensifer meliloti 12531f(12531f),同时根部浇灌无菌蒸馏水获得的种子,采用信封、信封+布袋、铝箔3种包装材料,分别在25℃、25℃硅胶干燥、-4℃和4℃条件下贮藏6个月后,检测种子内根瘤菌的定殖数量。结果表明:主根微破损接种gn5f获得的种子在-4℃以信封包装贮藏时内生根瘤菌的定殖数量(25.54cfu/粒)显著高于信封+布袋和铝箔的两种包装材料(P0.05),主根微破损接种12531f获得的种子在-4℃以铝箔包装贮藏时内生根瘤菌的定殖数量最高(14.98cfu/粒),但与另外两种包装材料无显著差异(P0.05)。根部浇灌接种gn5f和12531f获得的种子,在25℃干燥贮藏,分别以信封(22.08cfu/粒)和信封+布袋(40.84cfu/粒)包装时内生根瘤菌的定殖数量显著高于其贮藏条件(P0.05),添加苦参碱根部浇灌接种gn5f和12531f获得的种子以铝箔为包装材料,分别在-4℃(25.00cfu/粒)和25℃硅胶干燥(18.08cfu/粒)温度下贮藏种子内生根瘤菌的定殖数量最多,显著高于其他贮藏条件(P0.05)。接种相同目标根瘤菌获得的种子以25℃硅胶干燥和-4℃贮藏时内根瘤菌数量高于25℃和4℃。     

紫花苜蓿根瘤菌分子分型和生物型划分研究

根据表型和共生效应,对种内根瘤菌划分生物型,为苜蓿与根瘤菌高效共生育种提供理论依据。以分离自甘肃省3个栽培区域5个苜蓿品种植株不同部位的根瘤菌株为材料,进行16SrRNA测序、多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)、表型数值分类和共生效应测定。结果表明,78株初筛菌经16SrRNA和MLST分析有20株属于Rhizobium radiobacter;表型特征数值分类将其聚为7个群。接种5个苜蓿品种,选择对共生效率贡献率最大的地上干重进行多重比较。当接种处理地上干重显著高于未接种处理CK时标记共生效应为A,与CK差异不显著时标记为B,显著低于CK时标记为C。以苜蓿品种为甘农3号、甘农9号、陇中、清水和WL168HQ的顺序,将各菌株共生效应结合,形成6种共生模式。结合表型和共生模式,20株R.radiobacter被划分为14种生物型,WL168HQ、甘农3号和陇中苜蓿品种内生物型多样性丰富,甘农9号和清水苜蓿品种内生物型单一。综上所述,根据表型特征和共生模型可以进行种内根瘤菌株的生物型划分,苜蓿品种内根瘤菌生物型多样性丰富。     

接种不同根瘤菌对紫花苜蓿生产力的影响

研究5株不同苜蓿根瘤菌菌株（Sinorhizobium meliloti）在两种土壤类型下分别与紫花苜蓿品种‘龙牧806’（Medicago sativa L.×Medliloides ruthenica Sojak.‘Longmu 806’）和‘中苜3号’（Medicago sativa L. ‘Zhongmu NO.3’）的盆栽接种效果。结果表明：在不同土壤类型中,根瘤菌接种效果有显著差异。泥炭土壤中,‘龙牧806’接种增产效果最好的是菌株ACCC17578,‘中苜3号’接种增产效果最好是菌株ACCC17551,株高、地上部干重、全氮量分别比对照提高了90.6%和165.8%、65.2%和275.7%、64.5%和22.8%;沙土条件下,‘龙牧806’接种增产效果最好的是菌株ACCC17675,‘中苜3号’接种增产效果最好的是菌株ACCC17512,株高、地上部干重、根干重分别比对照提高了13.2%和22.8%、31.2%和48.6%、40.4%和74.7%。研究表明高效的苜蓿根瘤菌可有效提高紫花苜蓿生产力,该结果可为进一步的田间生产实践提供理论依据。     

紫花苜蓿-根瘤菌高效共生体筛选及田间作用效果

从中国农业大学根瘤菌菌种保藏中心筛选出19株紫花苜蓿根瘤菌,利用河北吴桥的土壤,经温室盆栽试验筛选出适合Vector紫花苜蓿品种的3株高效根瘤菌CCBAU30138,CCBAUN210及CCBAUN96077.并将3株菌进行田间接种效果验证,田间试验结果表明,接种CCBAU30138,CCBAUN210和CCBAUN96077后,全年干草产量分别比对照增加11.9%,10.2%和13.7%,单位面积蛋白质产量比对照增产19.63%,15.63%和13.59%.上述结果说明,通过土壤筛选的高效根瘤菌可以应用到生产中.     

黄腐酸对紫花苜蓿根瘤菌内生定殖及幼苗生长的影响

黄腐酸（Fulvic acid,FA）是一种植物生长调节剂,可促进植物生长。为探索FA对根瘤菌生长、菌株内生定殖及幼苗生长的影响,本试验以3株青色荧光蛋白标记根瘤菌株Rhizobium LH3436f（3436f）、Rhizobium GN5f（gn5f）和Ensifer meliloti 12531f（12531f）为材料,筛选出有利于各标记根瘤菌生长的FA浓度,添加到根瘤菌液中并接种于苜蓿幼苗根系,检测根瘤菌结瘤、苜蓿幼苗生长和菌株内生定殖情况。结果表明：添加适宜浓度FA可显著促进标记根瘤菌侵染根系和在苜蓿体内定殖,12531f根瘤菌添加0.02% FA后接种苜蓿,其在根中的内生定殖数量达到单独接种的11.18倍,差异显著（P<0.05）;根瘤菌添加FA接种可明显促进苜蓿结瘤和生长,效果最佳的是3436f添加0.01% FA接种;根瘤菌添加FA接种也使苜蓿叶绿素含量显著提高,gn5f添加0.02% FA时苜蓿叶片叶绿素含量最高,显著高出WCK 111.41%（P<0.05）。因此,FA可促进根瘤菌在苜蓿幼苗内的定殖,二者可协同促进苜蓿幼苗生长。