茶树NUDIX基因家族的鉴定及表达分析

NUDIX水解酶属于焦磷酸酶,在信息传递、植物生长协调和响应逆境胁迫等方面起着重要作用。基于茶树(Camellia sinensis)基因组鉴定出43个NUDIX家族基因,并运用生物信息学和实时荧光定量PCR等方法对其分析。结果表明,43个CsNUDXs蛋白质分子量介于11.8～89.2 kDa,氨基酸长度为102～342个,理论等电点为4.49～9.26,18.6%的蛋白为稳定性蛋白;根据进化关系将CsNUDXs分为6个亚家族;启动子顺式作用元件分析发现CsNUDXs具有许多与激素响应、逆境胁迫和生长发育等调控相关的作用元件;对CsNUDXs家族基因在不同器官表达模式进行分析,发现CsNUDX3、CsNUDX7在果实中表达量较高,而CsNUDX22、CsNUDX25在果实中表达量极低,CsNUDX30在老叶中表达量极低;不同处理组的实时荧光定量PCR结果表明,1 mmol·L^-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理下CsNUDX1、CsNUDX2和CsNUDX33等表达量呈现先升后降再升的趋势,而1 mmol·L^-1水杨酸(SA)处理下CsNUDX4...     

茶树CsLOG基因家族的鉴定和表达模式分析

LONELY GUY(LOG)酶是植物激素细胞分裂素(CK)激活酶,是植物芽和根尖分生组织活性的重要调节剂.本研究基于茶树全基因组数据,鉴定出13个LOG基因,对其基因结构、保守基序和系统发育进化等生物信息进行分析,结果表明:13个茶树CsLOG基因在茶树染色体上分布不均;根据进化关系将茶树LOG基因分两个亚家族(G1,G2);启动子顺式作用元件分析与多种激素及非生物响应相关.表达模式分析显示:LOG基因主要在芽、叶和花中表达,不同胁迫处理下表达具有差异,说明CsLOG基因广泛参与茶树生长发育和非生物胁迫响应,本研究为进一步探究CsLOG基因提供参考.     

茶树WOX基因家族的鉴定和表达模式分析

WOX转录因子在植物的生长发育和非生物胁迫响应中起着重要的调控作用.文章基于全基因组数据,从茶树基因组中鉴定出29个WOX基因,并对其基因结构、进化关系、保守域、染色体定位进行分析,同时分析了它们在PEG诱导的干旱胁迫、盐胁迫处理中的转录组数据.结果表明,29个CsWOX(茶树WOX)基因在茶树染色体上分布不均;根据进...     

茶树OSCA基因家族的鉴定及表达分析

钙通透性阳离子通道蛋白（OSCA）在植物调节高渗胁迫中发挥着重要作用。为了解OSCA基因家族在茶树响应干旱胁迫中的作用,本研究基于茶树全基因组数据对OSCA基因家族进行鉴定,分析CsOSCAs基因和蛋白结构以及启动子顺式作用元件,并对CsOSCAs在茶树不同组织、不同抗旱性品种间和干旱胁迫下的表达模式进行分析。结果表明：茶树基因组包含12个OSCA基因家族成员,分别命名为CsOSCA1～CsOSCA12;CsOSCAs基因编码的氨基酸序列长度为667～831 bp,蛋白分子量在76 630.55～93 563.99 kDa之间,等电点在6.15～9.33之间,含有9～12个跨膜结构域,均含有特征保守结构域DUF221,根据系统进化关系可以分为4个亚族;10个CsOSCAs基因定位于茶树7条染色体上,2个CsOSCAs基因定位于未锚定染色体的contig上;CsOSCAs基因编码的蛋白二级结构含有32%～38%的跨膜结构和60%～68%的α-螺旋;CsOSCAs基因具有组织表达特异性,CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA11、CsOSCA12基因在干旱敏感的品种CN98中的表达量...     

茶树CLH基因家族的鉴定与转录调控研究及其在白化茶树中的表达分析

叶绿素酶（Chlorophyllase,CLH）是叶绿素降解过程中的关键酶,将叶绿素a脱去植醇,形成脱植基叶绿素a。以白化茶树白鸡冠新梢叶片为材料,克隆获得3条CsCLHs基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析。结果表明,3条CsCLHs基因分布于2个亚家族,其蛋白质编码区（Coding sequence,CDs）长度为894~975 bp,编码氨基酸个数为297~324,蛋白质分子量为31.99~34.91 kDa,等电点为4.89~7.61,不稳定系数为38.94~48.24,其中CsCLH1.1和CsCLH1.2为不稳定蛋白,CsCLH2为稳定蛋白。Cell-PLoc亚细胞定位预测结果表明,3个CsCLHs蛋白均定位于叶绿体;而WolfPsort亚细胞定位预测结果显示,CsCLH1.1和CsCLH1.2定位于细胞质,CsCLH2定位于叶绿体。遮阴和恢复光照处理下的qRT-PCR结果显示,遮阴抑制白鸡冠叶片CsCLHs的表达,光照诱导白鸡冠叶片CsCLHs的表达。不同品种中CsCLHs表达模式分析表明,CsCLH1s在白化叶中高表达。另外,酵母单杂交结果表明,CsCDF5可以与CsCLH1.1和CsCLH2启动子结合。综上所述,CsCLHs在白化茶树叶片中可能参与叶绿素降解,在叶片白化过程中发挥重要作用,结果可为进一步探究茶树CLH基因家族的功能及茶树叶片白化机理提供参考。     

茶树多酚氧化酶基因的SNP分析

选取有代表性的40个茶树品种（系）为材料,先采用PCR-SSCP-银染检测技术,对供试材料的多酚氧化酶（PPO）基因进行SSCP分析,对PPO基因作初步基因分型;根据分型分析结果,对每一类型选择典型品种的PPO基因作进一步的DNA序列分析,用DNASTAR Program进行单核苷酸多态性（SNP）搜寻。     

我国茶树遗传育种的一项重要突破浙江大学茶学系克隆茶树多酚氧化酶基因获得成功

日前,在浙江大学博士学位论文答辩会上,茶学系在职博士研究生赵东的博士论文“茶树多酚氧化酶基因的克隆和转化系统的研究”得到了专家的高度评价.该项研究采用nest PCR技术在国际上首次成功地克隆出与茶叶品质、人体健康密切相关的茶树多酚氧化酶基因,并在GenBank(美国国家生物技术信息中心核苷酸数据库)登录,开创了我国茶树育种研究的新领域.     

茶叶多酚氧化酶的序列分析与结构预测

调用生物信息学方法对已在国际互联网上的生物数据库(DDBJ、Uni-Prot)注册的茶树多酚氧化酶基因的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、信号肽、跨膜拓扑结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构进行预测与推断。结果表明:茶多酚氧化酶不具有信号肽,存在卷曲螺旋,为位于细胞质中的无跨膜的亲水性不稳定蛋白,无规则卷曲是其蛋白质结构的主要结构元件,α-螺旋与β-折叠分散于整个多肽链中,并存在2个结构功能域。     

茶树多酚氧化酶基因的PCR-RFLP多态性分析

采用PCR-RFLP技术,检测茶树多酚氧化酶(PPO)基因中4个限制性核酸内切酶酶切位点在不同品种中的多态性,以研究其与品种适制性及遗传背景的关系。遗传参数分析表明:4个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),HpaⅡ酶切位点(引物L7/L8扩增区段)呈现高度多态,BsuRⅠ酶切位点呈现中度多态,这2个酶切位点在不同品种中的基因型分布与品种的遗传背景有直接的关联,可作为遗传标记应用于茶树品种遗传亲源关系分析与亲子鉴定。HpaⅡ酶切位点在引物L7/L8扩增区段存在丰富的多态性,且与品种适制性具有明显关联,适制红茶的品种多为AA基因型,此位点能被HpaⅡ内切酶完全酶切;适制绿茶与乌龙茶的品种多为BB型或AB型,此位点不能被酶切或不能完全被酶切,该HpaⅡ酶切位点可作为茶树品种适制性早期鉴定的遗传标记。对引物L7/L8扩增区域的HpaⅡ酶切位点在祁门4号×潮安大乌叶F1代群体进行分型检测的结果表明,该位点在F1代的分离符合孟德尔遗传规律(x2=0.23)。     

茶树多酚氧化酶基因的克隆及其序列比较

根据已经发表的多酚氧化酶基因中的保守序列 ,设计兼并引物 ,利用nest-PCR技术 ,首次克隆了茶树多酚氧化酶基因。该基因已经在GenBank上登录 ,登录号为AF2 69192。序列分析表明 ,茶树多酚氧化酶基因与其它植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性 ,尤其在铜离子结合部位 ,所有的植物基本上一致。进化树分析表明 ,茶树的多酚氧化酶可以与大多数的木本植物聚合成一个组     

茶树多酚氧化酶基因的生物信息学分析及原核表达

通过PCR方法扩增出迎霜品种茶多酚氧化酶（PPO）的编码区序列,并将其登录于GenBank,注册号为GQ214317。生物信息学分析表明,该基因编码区全长1800bp,编码599个氨基酸,分子式为C₃₀₀₈H₄₆₇₇N₈₁₃O₉₀₀S₁₈,存在两个铜离子结合域,没有跨膜区;进化树分析表明,茶与毛叶茶亲缘关系最近。成功构建了原核表达载体pET-ppo,并转化E. coli BL21（DE3）,实现了PPO的原核表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,在71KD处有一条特异蛋白条带,与预测大小相符。     

茶树Copine家族基因CsBON3的克隆与表达分析

Copine蛋白是一类包含2个C2(N端)和1个vWA(C端)保守域的Ca~(2+)依赖蛋白或磷脂结合蛋白,在胞内信号转导中发挥重要作用。基于序列相似性分析,从茶树转录组数据库中筛选出1条与Copine家族基因高度同源的EST序列。经测序验证该序列包含1 746 bp的完整ORF,编码581个氨基酸。同源比对显示该基因与拟南芥At BON3序列相似度最高(65%),将其命名为CsBON3(Gen Bank登录号为KY435900)。生物信息学分析显示,CsBON3蛋白分子量为63.66 k D,理论等电点为5.48;具有Copine家族蛋白特有的保守结构域;属亲水性蛋白,无信号肽位点,非分泌性蛋白,无跨膜结构域。表达分析表明,CsBON3在茶树花和根系中表达量最高,茎干和成熟叶中表达量最低。低温(4℃)处理茶树1 d后,其表达被显著上调;在生长阶段,该基因表达量高于休眠阶段;同时在接种炭疽菌的茶树叶片中,该基因也被快速上调,表明该基因可能与茶树低温、生长发育及抗病相关。     

茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

采用EST测序技术和3′RACE技术,获得了茶树儿茶素代谢途径中的一个重要酶—无色花色素还原酶的全长基因,在GenBank的登录号为EF205148,序列全长1 301 bp,其中开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5 kD,理论等电点为5.81。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约60 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性,例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70%、68%、71%。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况,结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性,而其他基因则与其相关性不大。     

茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析

茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一,含有许多有价值的次生代谢产物,如儿茶素类物质。分离和克隆重要的茶树功能基因,对利用基因工程技术进行茶树遗传调控具有重要意义。本文采用EST测序技术和T4RNA连接酶介导的5′RACE技术,获得了一个茶树儿茶素代谢中的重要基因—查尔酮异构酶（CHI）基因,在GenBank登录（DQ904329）,其序列全长1 163 bp,其中开放阅读框长723 bp,编码240个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为26.4 kD,理论等电点为5.19。序列分析表明它与番茄CHI基因序列的亲缘关系比较近。     

白鸡冠茶树CsPPH基因全长cDNA克隆与表达分析

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,它能使脱镁叶绿素a转化为脱镁叶绿酸a,脱镁叶绿酸a是叶绿素降解途径中最后一个保持植物绿色的产物,被认为是叶片衰老和黄化的关键步骤。以新梢白化茶树白鸡冠叶片为材料,克隆获得CsPPH基因cDNA的全长序列（登录号：MK359094）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,CsPPH全长为1 298 bp,包含的ORF序列为1 241 bp,编码413个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定疏水蛋白,其预测分子量为45 741.50 Da,理论等电点为6.12。预测该基因主要定位于叶绿体中。qRT-PCR结果显示,遮荫抑制白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素升高,叶色变绿;光照促进白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素降解,导致叶片白化。     

产多酚氧化酶茶树内生真菌的筛选及产酶条件优化

以愈创木酚、α-萘酚、没食子酸、L-酪氨酸和单宁酸等5种酚类物质为底物,采用鉴别培养基筛选法从14株茶树内生真菌中初筛获得4株产多酚氧化酶的真菌。根据变色圈的大小、颜色深浅和摇瓶发酵的结果复筛获得产多酚氧化酶能力较强的菌株CSN-13。对菌株CSN-13产酶营养条件进行初步分析,结果表明,在供试的6种碳源物质中,以麸皮对菌株CSN-13产多酚氧化酶的促进作用最为明显;供试的5种氮源物质中,以硝酸铵的促进作用最为明显;在发酵培养基中添加茶水,对产酶有明显的促进作用。采用正交设计对CSN-13产酶发酵培养基进行初步优化,优化后的培养基配方为：麸皮（40βg·L^-1）、硝酸铵（15βg·L^-1）、茶水（4βg·L^-1）、KH₂PO₄（2βg·L^-1）、MgSO₄·7H₂O（0.5βg·L^-1）、无水CaCl₂（0.075βg·L^-1）、CuSO₄·5H₂O（0.01βg·L^-1）。采用优化后的培养基,菌株CSN-13在28℃下培养5βd,酶活力达到241βU·mL^-1·min^-1,比优化前提高8.5倍。茶树内生真菌菌株CSN-13及其发酵产酶培养基的研究为多酚氧化酶的进一步开发打下了基础。     

茶树CsGPX基因全基因组鉴定和表达分析

为明确茶树谷胱甘肽过氧化物酶(CsGPX)基因与非生物胁迫的关系,本研究利用生物信息学手段在茶树基因组中筛选得到3条CsGPX基因,对其编码蛋白理化性质、基因结构、系统进化树、顺式作用元件进行了分析。结果表明,CsGPX包含完整GPX结构域和3段保守序列,都具6个外显子。预测启动子上有参与植物激素和非生物胁迫响应的顺式作用元件。使用实时荧光定量PCR测定该基因的表达谱,发现它们在不同组织中的表达有显著差异。进一步分析表明,CsGPX被低温、ABA、盐以及干旱处理上调表达,但CsGPX2和CsGPX3的表达受低温抑制。本研究为茶树CsGPX家族基因克隆和功能验证提供基础。