新疆野扁桃六个新S-RNase基因的克隆和序列分析

以我国闻名于世的珍稀野生果树新疆野扁桃为试材,利用蔷薇科果树自交不亲和性通用引物组合,采用S-RNase等位基因PCR扩增,RT-PCR和RACE等技术方法,克隆了新疆野扁桃不同株系的S-RNase基因,以期为新疆野扁桃自交不亲和分子机理的进一步研究提供基本的资料。结果表明:从新疆野扁桃不同株系中克隆鉴定出了6个新的S-RNase基因,分别命名为PteS_(10)(GeneBank登陆号:KJ755352),PteS_(11)(GeneBank登陆号:KJ755353),PteS_(12)(GeneBank登陆号:KJ755354),PteS_(13)(GeneBank登陆号:KJ755355),PteS_(14)(GeneBank登陆号:KJ755356)和PteS_(15)(GeneBank登陆号:KJ755357);并对这6个新基因进行了序列生物信息学分析,为基于新疆野扁桃自交不亲和特性的遗传改良以及分子调控模式奠定试验基础。     

2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

2个中亚杏S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆中亚杏(Prunus armeniaca)品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列,为分子手段调控杏自交不亲和性状奠定基础。【方法】以新疆栽培杏品种‘索格佳娜丽’和‘赛买提’为试材,利用RT-PCR克隆2个品种的花柱SRNase基因c DNA片段,RACE技术进行c DNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam软件分析2个基因的编码蛋白特性,MEGA 5.0构建进化树。【结果】从‘索格佳娜丽’中克隆了S_(52)-RNase(KF951503)基因,从‘赛买提’中克隆了一个新的S_(53)-RNase(KF975455)基因DNA和c DNA全长序列。S_(52)-RNase的DNA全长2 200 bp,c DNA全长765 bp,ORF(开放阅读框)长681 bp,编码226个氨基酸;S_(53)-RNase的DNA全长1 664 bp,c DNA全长907 bp,ORF长732 bp,编码242个氨基酸。BLASTP比对显示:这2个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为26.5 ku和27.5 ku,等电点为9.36和9.03,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,S_(52)与李(Prunus salicina,S_7)、S_(53)与大岛樱(Prunus speciosa,S_(13))亲缘关系最近,S_(52)和S_(53)处在2个不同的分支上,表现出较高的序列多态性,表明2个基因亲缘关系较远。【结论】获得了2个中亚杏品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列。     

2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析北大核心CSCD

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

扁桃SFB基因的克隆及其生物信息学分析

以新疆扁桃栽培品种麻壳的花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个全长为1131bp的SFB基因(Genbank登录号为:EU909685),命名为AcSFB10。该基因编码376个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序。经生物信息学分析,推测AcSFB10蛋白的分子式为C2000H3033N517O558S23,相对分子质量为43985.5,等电点为6.02,二级结构以α螺旋为主;理论推导半衰期大约为30h,不稳定参数为53.21,属于不稳定蛋白;并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起裂合酶的作用,特异性的识别底物,正好吻合了F-box蛋白的作用。     

20个中国李品种自交不亲和S-RNase基因型的鉴定

利用蔷薇科S-RNase通用引物Pru-C2/PruCE-R以及12对特异性引物,对贵州省栽培的20个中国李(Prunus salicina Lindl.)品种叶片DNA进行PCR扩增,鉴定其S基因型。结果表明：采用S-RNase通用引物,仅11个李品种扩增出2个条带;采用12对S-RNase特异性引物,既扩增出与通用引物一样的结果,又鉴定出2个品种的S基因型。共鉴定了13个中国李品种完整的S基因型：红心李S_hS₁₀,姜黄李S₁₀S₂₀,南方李S_iS₉,柰李S_hS_f,槜李S_hS₇,幸运S_bS_c,芙蓉李S_bS_i,大红袍S_dS₂₀,前卫红S_eS_h,玫瑰皇后、澳得罗达、黑宝石和秋姬李S_b     

欧李自交不亲和S-RNase基因型鉴定及序列分析

以欧李4个品种为试验材料,采用同源克隆的试验方法,克隆S-RNase基因并分析其序列特征,确定不同品种基因型,以期为欧李杂交育种亲本选择提供参考依据。结果表明:克隆鉴定得到5个新的S-RNase基因,编码氨基酸168～172个,相对分子质量为19.87～20.34 kDa,等电点(PI)为9.60～9.73,以丝氨酸磷酸化为主;二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主;同源性比对和结构分析表明,5个新的S-RNase均属于RNase T2基因家族,推导的氨基酸序列包含5个保守区(C1、C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV),具有与李属、梨属、苹果属S-RNase相似的保守结构;进化分析显示欧李S-RNase与李属果树S-RNase聚类在一起,亲缘关系较近。     

中国樱桃泰山干樱S-RNase基因的克隆及序列分析

以中国樱桃品种泰山干樱为试材,利用李属植物C2、C5保守区引物,扩增花柱S-RNase基因,获得4个S等位基因,测序结果表明序列大小分别为:1608、950、796、504bp。根据同源比较发现大小为796bp的等位基因与基因库中登录的S1-RNase为同一基因,其它3个S-RNase基因为首次报道,依序列大小分别命名为S2(1608bp,登陆号EF541168)、S4(950bp,登陆号EF541173)和S6(504bp,登陆号EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3区存在终止密码子,导致翻译提早终止;S4-RNase的C5区前有插入片断;S6-RNase在高变区比其它S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较分析表明,中国樱桃S-RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S-RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。     

扁桃自交不亲和基因的多态性分析

 根据蔷薇科树种S基因的保守序列设计引物, 利用PCR技术对8个新疆扁桃品种S基因进行扩增, 获得了10个大小不同的S基因片段。测序结果表明, 这些DNA片段的核苷酸序列中都具有编码蔷薇科S-RNAase 5个高度保守区域: C1、C2、C3、RC4、C5的序列、编码高变区(RHV) 的序列以及变异度很大的内含子序列, 并且其高变区和内含子序列具有扁桃S基因特异性。同源性分析表明, 获得的10个氨基酸序列与蔷薇科中李亚科S2RNase的氨基酸序列同源性达67% ～96% , 扁桃与樱桃、杏应同属于李亚科。     

月季自交不亲和性S-RNase的鉴定与分析

以月季'月月红'(Rosa chinensis' Slater's Crimson China')和'2015-58-20'(Rosa sp.)为材料进行自交和异交,授粉花柱中花粉管荧光显微镜观察结果显示月季为典型的配子体自交不亲和植物.通过与已知蔷薇科自交不亲和S-RNase基因的序列进行比对,在'月月红'中克隆到R...     

苹果自花结实性品种花柱S - 核酸酶基因的克隆

 从苹果二倍体品种‘Ontario’和‘迎秋’花柱中分别克隆到了两个S - 核酸酶基因。同源性比较结果, ‘Ontario’和‘迎秋’都有一个与‘富士’Sf - 核酸酶基因完全相同的序列。‘Ontario’另一个S等位基因编码一个新的S - 核酸酶, 被命名为S8 - 核酸酶; ‘迎秋’另一个S等位基因与苹果‘红茜’的Sd - 核酸酶基因序列相同。     

苹果LEAFY同源基因的cDNA克隆与表达分析

 从苹果的果台枝顶芽中克隆了两个长约1.4 kb的cDNA片段，分别定名为AFL1和AFL2。它们的碱基序列在编码区有90%的同源性，但在3’末端非编码区仅有约印％的同源性。它们表达的肽链氨基酸序列与小叶杨、大豆、矮牵牛等有70％以上的同源性，与番茄、金鱼草、拟南芥有近70%的同源性，证明它们是LFY的同源基因。RT-PCR的结果表明，生长期AFL2在萼片、子房、根、茎、叶以及果台枝顶芽中都有表达，而AFL1只在果台枝顶芽中表达；在不同发育时期的果台枝顶芽中，AFL1在顶芽停止营养生长转向生殖生长以后才清晰表达，而AFL2在生长期6~10月都有表达。因此认为苹果中的这两个LFY同源基因虽有共同的起源，但是在功能上存在差异，在花和营养组织的发育中起不同的作用。DNA印迹分析表明，在苹果属及近缘的梨属植物中LFY同源基因是多拷贝的。     

槜李等15个李品种S基因型鉴定及其多态性分析

利用李属S-RNase基因特异性引物,对15个供试李品种进行PCR扩增,共获得30个目的条带。对这些目的条带进行测序鉴定出15个李品种的S基因型。通过与NCBI中利用BLASTn与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB等数据库中的序列比对,结果表明,其中9个为新S-RNases基因,对9个新S-RNases核苷酸序列进行分析发现,位于高变区内的内含子大小为141～1758bp,其同源性为33.9%(S-18～S-19)～81.6%(S-20～S-21),表现出丰富的长度和序列多态性;编码区的核苷酸序列比对结果,其同源性为73.3%(S-16～S-19)～91.7%(S-17～S-22);其推导氨基酸序列相似性为67.3%(S-16～S-19)～89.1%(S-17～S-22);包含李属S-RNase一级结构所共有的C2、C3保守区和高变区(RHV)。系统进化分析表明,9个新S-RNases与李属其它树种S-RNases聚类在一起,归属为李亚科(Prunoideae)。     

新疆野生樱桃李S-RNase基因分离与鉴定的初步研究

 从4对已报道的李属树种S-RNase基因引物组合中筛选出扩增效果较好的PruC2和PruC4R组合,首次对新疆野生樱桃李（Prunus cerasifera Ehrh.）的45个株系的基因组DNA进行S-RNase基因特异性PCR扩增,并对其PCR产物进行克隆测序。这些核酸序列及其相应的氨基酸序列在GenBank中进行比对, 皆与李属的S-RNase基因有最大同源性,为新疆野生樱桃李的4种S-RNase基因,分别命名为S₁ （511 bp）,S₂ （787 bp）,S₃ （1859 bp）和S₄ （464 bp）,在GenBank的登录号分别为EF638726、EF641276、EF661873和EF661874。45个株系中,43个株系的S基因型分别为S₁S₂、S₁S₃、S₂S₃、S₂S₄和S₃S₄,而10号和15号株系分别只鉴定了一种S-RNase基因,其S基因型组成有待于进一步研究。     

梨20个品种S基因型的鉴定及新S-RNases基因克隆

 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的S基因型,应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,鉴定了20个梨品种和野生类型个体的S基因型。起源于我国的'奥连'(S_pS₃₂)、'吊蛋'(S_dS_e)、'沙疙瘩'（S₃₆S_d）品种和杏叶梨的一个类型（S₂₂S_c）个体中存在西洋梨的S-RNase基因,证明S-RNase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋子梨的'麦梨'、'内蒙古山梨'中发现了2个新S-RNases基因,命名为S₄₀-、S₄₁-RNase（DQ903313、DQ988687）。S₄₀-和S₄₁-RNase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属S₁₁-和S₆-RNase的同源性为100%和94.4%,这表明S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。     

扁桃的栽培及研究概况

扁桃(Amygdalus communis L.)属蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物,为世界著名的干果树种,起源于中亚细亚,约6000年的栽培历史,大面积栽培始于19世纪后期。目前扁桃的引种栽培遍及美国、西班牙、希腊、意大利、土耳其等32个国家和地区,其中美国的栽培面积及产量均居世界之首。在我国,栽培扁桃的分布和产区位于新疆的南部,目前的栽培面积约10000hm~2。2001年世界扁桃总产量为610769t,其中美国的年总产量为397000t,其产量的75％出口到40多个国家,创汇5.87亿美元。综合有关文献介绍了世界扁桃的分布、产业发展和我国扁桃的引种、栽培概况及国内外扁桃的研究进展情况。     

甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物, 采用RT-PCR方法从甜瓜花后25 d的果实总RNA中扩增出目标cDNA片段, 克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明, 该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为98.9% , GenBank中登记号为DQ355797。通过Northern blot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化, 结果表明该基因在甜瓜果实花后25 d开始表达,随着果实的成熟, 表达量升高。