一株分泌抗猪γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞的鉴定

[目的]应用杂交瘤技术获得稳定分泌抗猪γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]先将原核表达产物His—PoIFN一γ免疫BALB／c小鼠4次,然后进行细胞融合,再以纯化的GST—PoIFN一1作为包被抗原,用间接ELISA筛选阳性杂交瘤无性系,最终获得能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对其进行问接ELISA和Westernblot检测。[结果]试验获得l株能稳定分泌抗猪IFN一1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,被命名为B3株,经间接ELISA和Westernblot检测,该株分泌的抗体能与融合蛋白His—PoIFN一γ和GST—PoIFN一γ发生特异性反应,而与其他表达鸡γ-干扰素、His和GST蛋白等的重组质粒均不发生反应。B3株分泌的抗体小鼠腹水的ELISA效价达到1：160000,抗体亚型为IgG1型,且轻链为κ链。[结论]该研究为建立猪γ-干扰素检测方法,研究机体的免疫状态及免疫机制提供了技术基础。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的鸡传染性支气管炎病毒免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Ag8．653融合。对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得3株能稳定传代并分泌抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F4F7D9、3E9G3D4、48883F8。通过间接ELISA、血凝抑制以及琼脂糖扩散等方法检测,3株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达10^6以上并且具有良好的特异性。     

KGF-2单克隆抗体间接ELISA筛选方法的建立

目的建立KGF-2单克隆抗体间接ELISA的筛选方法 ,制备KGF-2单克隆抗体.方法以KGF-2为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.通过棋盘滴定方法确定间接ELISA的抗原包被浓度及一抗、二抗最佳工作浓度;利用建立特异性好的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株.结果通过棋盘滴定最终确定了500μg/L的抗原包被浓度、1∶1 000的一抗血清稀释倍数及1∶2 000的二抗血清稀释倍数;筛选到两株可稳定分泌抗体、效价较高的杂交瘤细胞株.结论该研究建立了灵敏度高、特异性好的间接ELISA筛选体系,可用于KGF-2单克隆抗体的制备及检测.     

鸡IgG单克隆抗体的制备与鉴定

[目的]制备鸡免疫球蛋白单克隆抗体,提高诊断鸡特异性抗体的水平。[方法]应用盐析法粗提和葡聚糖G200凝胶层析分离纯化鸡血清IgG,免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合和ELISA筛选。[结果]间接ELISA法检测C44、C45、C67和C68共4株鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞的腹水效价分别为1∶640000、1∶320000、1∶640000和1∶80000。Westernblot分析显示,C44和C45株单克隆抗体识别鸡IgG轻链,而C67和C68株单克隆抗体识别鸡IgG重链,它们与鸭、猪等血清Ig均没有反应。小鼠Ig亚类分析表明,4株细胞分泌的抗体均为IgG1型。[结论]成功获得了4株稳定分泌鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞。     

抗牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以从黑龙江省腹泻犊牛粪便中分离的牛轮状病毒(bovine rotavirus)为抗原,免疫6～8周龄BALB/_c小鼠,取血清抗体阳性小鼠的脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞融合。用ELISA间接法检测抗体,通过有限稀释法,克隆出一株分泌抗牛轮状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定,此杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为IgM,轻链为K链。通过连续传代证明,此杂交瘤细胞株具有稳定分泌单克隆抗体的性质。杂交瘤细胞诱生BALB/_c小鼠腹水的单克隆抗体滴度可达1:10000以上。     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体的研究

 采用纯化的鸡IgG免疫环磷酰胺预处理BALB/c小鼠后，再用亲和层析纯化的鸡IgM进行免疫，运用淋巴细胞杂交瘤技术，以间接ELISA法筛选，获得了5株能稳定地分泌抗鸡IgMμ链特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA交叉反应性试验和羊抗鸡IgMμ链抗血清阻断试验，证明这5株单克隆抗体均是抗鸡IgMμ链特异性的。采用环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体，其杂交瘤细胞阳性率为8.696%,而用常规免疫法为4.032%,前者比后者杂交瘤细胞阳性率提高1倍以上。经两次有限稀释法克隆和比较后，免疫抑制法获得5株单克隆抗体，而常规免疫法只获得2株单克隆抗体，前者有3株单克隆抗体腹水ELISA效价达到10#+（-12）、10#+（-14）、10#+（-15）；后者单克隆抗体腹水ELISA效价为10#+（-5）和10#+（-6）。因此，与常规免疫法相比，环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体具有杂交瘤细胞阳性率高，分泌的单克隆抗体特异性强、滴度高等优点，值得推广。     

广谱性识别H7亚型禽流感病毒HA蛋白的单克隆抗体制备与鉴定

H7N9亚型禽流感病毒（AIV）的快速进化与变异使得其逃脱现有抗体的识别,为提供H7亚型AIV鉴别诊断所需重要材料,制备可识别H7亚型AIV HA蛋白的单克隆抗体（mAb）。采用差速离心法纯化的H7N9亚型AIV(A/Chicken/Guangdong/SW154/2015)免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,采用血凝抑制（HI）试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）和间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株。结果显示,获得5株稳定分泌抗H7N9 AIV HA蛋白mAb的杂交瘤细胞,腹水ELISA效价均为1∶1 000 000;其中,4株mAb的重链为IgG1,1株mAb的重链为IgG2b,轻链均为κ链。特异性测定结果显示,5株mAb仅与H7亚型AIV反应,不与其他亚型流感病毒发生反应;广谱性测定结果显示,5株mAb均可与不同年份分离出的H7亚型AIV发生反应;HI结果显示,腹水针对H7-Re3抗原株的HI效价为7 log2～12 log2;MDCK细胞微量中和试验结果显示,5株mAb均具有中和活性;Dot blot检测结果显示,5株mAb均可识别H7-Re2抗...     

DNA免疫制备猪传染性胃肠炎病毒S蛋白单克隆抗体

利用含有猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点的重组质粒PCI-Sa免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA方法进行筛选和有限稀释法3次克隆,获得1株稳定分泌抗TGEV重组S蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为E6D9A12,其染色体平均计数为88±10对,间接ELISA检测制备腹水抗体效价为1:6×105,分泌抗体亚类为IgG2a型。杂交瘤细胞上清与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪伪狂犬病病毒(PrV)均不发生交叉反应;与TGEV感染细胞经间接免疫荧光检测均呈黄绿色荧光;与TGEV经Dot-ELISA检测呈特异性反应。     

应用ELISA间接法检测抗IBDV单克隆抗体

本文用 ELISA 间接法,研究并建立了抗鸡传染性法氏囊病毒单克隆抗体的检测体系。实验证明,该法具有简便、灵敏、迅速、特异性强、准确性高及重复性好的优点。是研究筛选抗 IBDV单抗杂交瘤细胞的可靠方法。     

鸡MHCⅡ类分子部分基因的原核表达及单克隆抗体的制备与鉴定

[目的]制备鸡MHCⅡ类分子的单克隆抗体。[方法]在分析鸡MHCII类分子蛋白序列基础上,选取鸡MHCⅡα链基因第2～6外显子和β链基因第3～6外显子进行原核表达,以纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆和间接ELISA筛选阳性细胞株。[结果]共得到1株分泌鸡MHCⅡα链抗体和2株MHCⅡβ链抗体的杂交瘤细胞,分别命名为MHCⅡα-4、Ⅱβ6-2和Ⅱβ6-31,其腹水效价分别为1∶256000、1∶256000和1∶1280000。Western blotting分析表明其特异性强,能与相应蛋白结合。[结论]成功获得了3株稳定分泌抗鸡MHCⅡ类分子抗体的杂交瘤细胞。     

鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16 ℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-ChPrnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。     

H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立

【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病,该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）,并且一直处于动态重组过程中。因此,建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法,加强H9亚型流感的监测,具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率;用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,HABA法检测抗体生物素化的效率;待测抗原与钌标单抗作用1 h后,将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应,最后加入反应底物三丙胺后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度,确定临界值和反应谱,对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后3 d和5 d,采集攻毒组和空白对照组鸡只的88份咽拭子和肛拭子,分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗H9亚型AIV单克隆抗体的标记效率为每个单抗IgG分子上结合21个Ru²⁺,且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性;生物素化兔抗H9N2亚型AIV多克隆抗体的标记效率为每个IgG分子上结合了6个生物素分子,且Western blotting试验证明其仍保持生物活性;该方法的检测临界值为28.3,可疑区间为23.4-33.2;阴性和阳性变异系数均小于10%;检测限为5×10⁴EID₅₀,能够特异性地检测H9亚型AIV,不与其他亚型流感病毒（H1、H3、H4、H5和H6亚型）和其他类型的禽源病毒（NDV、IBV和IBDV）反应。3 h内即可完成检测,与鸡胚病毒分离法的符合率为86.4%。【结论】所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测,对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。     

嗜水气单胞菌HEC毒素单克隆抗独特型抗体研究

用嗜水气单胞菌ＨＥＣ毒素免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，通过一次性杂交瘤融合，在筛选ＨＥＣ毒素单克隆抗体（ＭｃＡｂ１）的同时，用兔抗ＨＥＣ毒素血清（ＰＡｂ）包板的ＥＬＩＳＡ方法，筛选到两株抗ＨＥＣ毒素的单克隆抗独特型抗体（ＭｃＡｂ２）。两株ＭｃＡｂ２腹水ＥＬＩＳＡ效价分别为１：２０４８０和１：５１２０，属于ＩｇＧ１亚类。ＨＥＣ毒素的模拟抗原ＭｃＡｂ２不能溶解人的Ｏ型红细胞，但能与相应的ＰＡｂ反应，并能阻断ＰＡｂ与ＨＥＣ毒素的结合。将ＭｃＡｂ２连接到同源小鼠红细胞（ＭＲＢＣ）后免疫小鼠，用ＨＥＣ毒素包板的ＥＬＩＳＡ检测其血清，呈阳性结果，说明ＭｃＡｂ２能模拟ＨＥＣ刺激机体产生抗ＨＥＣ毒素的抗体（Ａｂ３）。     

抗沙丁胺醇单克隆抗体制备与鉴定

[目的]制备特异性抗沙丁胺醇单克隆抗体,为其免疫学检测方法的建立奠定基础。[方法]用SAL-BSA抗原免疫BALB/c小鼠;使用细胞融合技术建立抗SAL的单克隆抗体（SAL mAb）杂交瘤细胞株;体内诱生腹水法制备SAL mAb,并鉴定其免疫学特性。[结果]筛选出2D9和1C4两株杂交瘤细胞,其细胞培养上清效价达1∶104,腹水效价达1∶106;免疫球蛋白亚型鉴定为IgG1;抗体对SAL的半数抑制浓度（IC50）为1.14 ng/ml;与沙丁胺醇和盐酸克伦特罗的交叉反应率（CR）分别为100.00%和26.09%,与其他化合物无交叉反应。[结论]获得了高效价、敏感且异性的抗SAL抗体,为沙丁胺醇残留的免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

鸡大肠杆菌1型菌毛单克隆抗体的研制

将菌毛化的大肠杆菌C600（fim^ ）经0.3%甲醛灭活后作为免疫原，经淋巴细胞杂交瘤技术，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选获得1F4－1和2C32株抗F1菌毛a或b因子抗原单抗和1株抗F1c因子抗原单抗，它们均为IgG1。免疫印迹试验结果表明：3株单抗均能同禽大肠杆菌1型菌毛反应，识别分子质量为17ku左右的菌毛蛋白。同时对沙门氏菌及猪源大肠杆菌进行检测，结果均无交叉反应性，说明禽病原性大肠杆菌F1菌毛与沙门氏菌1型菌毛及猪大肠杆菌粘附素之间存在很大差异。     

基于SodC单克隆抗体的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法的建立及应用

【目的】胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis,LI）是引起猪增生性肠炎（porcine proliferative enteritis, PPE）的肠道病原菌,主要表现为动物福利下降,给世界养猪业造成严重的经济损失。研究通过制备鼠抗LI SodC的单克隆抗体,建立一种针对LI的免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）抗原检测方法,检验其在临床上的应用性,从而为LI的病原诊断提供一种科学有效的手段。【方法】选取胞内劳森菌弱毒疫苗为研究对象,通过PCR扩增其sodc片段,将其克隆至原核表达载体pGex-6p-1上,成功构建出pGex-6p-1-sodc重组质粒,诱导表达重组蛋白SodC。Western Blot分析重组蛋白的反应原性,一抗使用鼠抗GST标签的抗体。以该重组蛋白为免疫原,免疫4—6周龄BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术、有限稀释法和间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞,并制备腹水。通过间接免疫荧光（IFA）鉴定该单抗的特异性。以该单抗为一抗,摸索并建立了LI IPMA抗原检测方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。用优化后的IPMA方法对来自江苏周边地区猪场回肠组织样品进行检测,评价该方法的临床价值。【结果】纯化后SodC蛋白浓度较高,与鼠抗GST标签的抗体发生特异性结合,表明该蛋白反应原性较好。经3次亚克隆后最终共筛选获得2株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1D6和1F7。单抗亚型鉴定结果显示：1D6亚型为IgA,1F7亚型为IgG3;ELISA检测1D6单抗效价为1﹕1 024 000;1F7单抗效价为1﹕1 024 000;间接免疫荧光（IFA）结果表明2株单抗均与LI菌株发生特异性反应,与猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Cholerasuis,S. Cholerasuis）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等猪常见病原无交叉反应。优化后IPMA反应条件为：一抗稀释倍数为1﹕800,作用45min;二抗稀释倍数为1﹕2 500,作用1h,此时IPMA检测效果最佳。用该方法检测S. Cholerasuis、PEDV、TGEV、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2（PCV2）均为阴性;最低检测限为10³个/mL,说明该方法特异性强、敏感性高。临床样品检测结果显示146份病料中共检测出92份阳性样品,3个不同猪场的阳性样品检出率分别为65.6%、68.2%和53.7%,总体阳性率为63.0%。普通PCR方法检测出82份阳性样品,两种方法的阳性符合率为94.6%。【结论】成功制备了鼠抗LI SodC蛋白的单克隆抗体,建立了针对LI抗原的IPMA检测方法,并对临床样品进行了检测。该方法具有良好的特异性和敏感性,并具有一定的临床价值,为实验室LI的分离鉴定、在感染细胞中的定位以及流行病学调查和相关检疫提供一种有效的技术手段。     

两种来源的IBDV抗原制备单克隆抗体的比较

[目的]比较以原核表达蛋白与纯化病毒制备单克隆抗体的特性。[方法]RT-PCR扩增IBDVVP2基因,通过原核表达系统表达目的蛋白,并亲和纯化重组蛋白。尿囊液扩增IBDV,并通过超速离心纯化病毒。分别用纯化的重组VP2蛋白和IBDV免疫Balb/c小鼠,ELISA筛选杂交瘤细胞株。[结果]获得了2株分泌VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价均为1∶2×104;4株分泌IBDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价分别为1∶2×106,1∶6×104,1∶1×105,1∶4×103。所有单克隆抗体均与其制备用免疫原反应,不与空载体或其他病毒抗原反应。经10～20次传代,仍保持稳定的效价。[结论]纯化的原核表达VP2蛋白和IBDV均能诱导小鼠产生免疫应答;用原核表达的VP2蛋白作为免疫原,可以获得特异的VP2抗体。