dsRNA介导的抗ToMV和CMV植物表达载体的构建

[目的]构建通过表达dsRNA,诱导植物基因沉默机制可抗2种病毒的表达载体.[方法]根据已报道番茄花叶病毒(ToMV)的运动蛋白基因(MP)和黄瓜花叶病毒(CMV)的沉默抑制子基因(2b)的核苷酸序列设计特异性引物,扩增到部分△MP和2b基因;然后通过重组PCR技术将2个病毒基因进行融合,获得长度为676 bp的融合基因△MP-2b.再将融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连,并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游.[结果]构建了含两种不同病毒来源基因的植物表达载体pBIN438△MP-2b(i/r).酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致.[结论]为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础.     

猪MSTN基因敲除载体的构建

MSTN基因在成年动物所有骨骼肌中都可检测到表达,其突变或缺失会导致肌肉量的增加。根据已知的MSTN序列设计引物,通过PCR的方法获得了同源臂序列,同源长臂5 382 bp,包括全部的外显子1、2,同源短臂844 bp,包括部分外显子3,在含有正负筛选标记基因的载体上插入上述2个同源臂,构建完成了替代型猪MSTN基因敲除的打靶载体——ploxpⅡ-MSTN,为后续获得MSTN基因缺失型细胞株奠定了试验基础。     

抑制14-3-3ζ表达的siRNA及其重组腺相关病毒载体的构建

[目的]通过构建靶向14-3-3ζ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒。[方法]设计靶向14-3-3ζ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果。从psiRNA质粒上扩增H1-si-ζ基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlu1酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达。[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功。病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装。[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ζ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3ζ相关的体内、外研究提供了试验基础。     

抑制14-3-3ξ表达的siRNA及其重组腺相关病毒载体的构建

[目的]通过构建靶向14-3-3ξ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒.[方法]设计靶向14-3-3ξ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果.从psiRNA质粒上扩增H1-si￡基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlul酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达.[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功.病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装.[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ξ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3￡相关的体内、外研究提供了试验基础.     

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。     

鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16 ℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-ChPrnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。     

通用山羊痘病毒TK基因缺失转移载体的构建

用PCR方法克隆了山羊痘病毒疫苗株(GTPV-TY)的TK基因,根据TK基因结构,设计了2对引物分别扩增得到与TK基因部分相邻的长度约1kb的同源重组臂序列,分别插入到pGEM-Teasy载体,通过SmaⅠ位点重新连接,并在此位点插入CMV启动子、多克隆位点、BGHpolyA信号以及LacZ基因,构建了通用山羊痘病毒TK基因缺失转移载体pdTK.此转移载体为改造GTPV-TY株以及开发二价或多价基因工程疫苗奠定了基础.     

猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验

【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的：构建HBVX基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体。方法：设计并合成HBVX基因的引物,以HBVDNA阳性血清PCR扩增得到HBVX基因全序列,将X基因连接到真核表达载体pCI—neo上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

猪流感病毒NP基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/ Swine/ Inner Mongolia/ 547/ 01 (H3N2)的NP基因,并将其克隆入pMD 18-T载体.重组pMD 18-T经Sal I 和 EcoR I酶切后得到的NP基因插入pMelBacB载体的Sal I/EcoRI位点.PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了pMelBacB-NP转移载体.这为开发NP诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础.     

伪狂犬病毒粤A株gE基因真核表达质粒的构建

根据伪狂犬病毒(PRV)NLA-3和Rice株的gE基因序列，设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BarnHI酶切位点的引物，以PRV粤A毒株（PRV-YA)基因组为模板，利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段，将这一片段克隆至PMDl8-T载体中，获得重组质粒PMID18-gE；用HindⅢ和BarnHI酶切该重组质粒，回收得到含有以上2个酶切位点粘端的gE基因，将此基因片段克隆至相同酶切、回收后的pcDNA3．1( )真核表达载体中，获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-gE，经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

新城疫病毒洛阳分离株HN基因真核表达载体的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从新城疫病毒洛阳分离株中扩增出HN基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建pcDNA3-HN重组质粒。通过用PCR扩增、酶切电泳分析的方法对重组DNA进行鉴定,成功构建了新城疫病毒洛阳分离株HN基因真核表达载体。     

表达猪细小病毒VP2基因重组伪狂犬病毒转移载体的构建

根据已发表的细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)NADL-2株全基因序列,设计1对引物,用PCR方法扩增出PPVVP2基因,将其克隆入pGEM-T载体中,获得了VP2基因的转移载体质粒,命名为pVP2。对含伪狂犬病病毒Min-A株gD、gI、gE、11K全基因,gG、28K基因部分编码区的质粒pPR128进行改造,用StuⅠ和SphⅠ双酶切,切去部分gI,gE基因。把两端带有StuⅠ和SphⅠ酶切位点的细小病毒VP2基因插入,构建了含VP2基因的转移载体pPR-VP2。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。     

梭菌氢酶基因部分片段的同源克隆及敲除载体的构建

为从分子水平探索典型铁还原菌-梭菌的铁还原能力与其氢酶产氢之间的关系,以从水稻土中分离得到一株具有高铁还原能力和高产氢能力的梭菌为材料,通过同源克隆获得长度为761bp氢酶基因的部分序列。生物信息分析发现,该基因片段覆盖氢酶的活性中心,是氢酶的主要功能结构域。采用Overlap PCR的方法构建含有四环素抗性基因的氢酶基因敲除载体(pMD-19-HTH),以期进一步构建氢酶基因缺失的梭菌突变体,为分析氢酶产氢与铁还原的关系奠定基础。     

种子特异启动子的DGAT基因植物表达载体构建

利用PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica,napus L.)的基因组DNA和拟南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA中分别扩增种子特异启动子napin和二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因片段,并将它们依次插入到植物表达载体pCAMBIA1390的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的DGAT基因植物表达载体p1390ND,冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105和AGL1中,PCR检测结果证明,重组质粒p1390ND已成功导入农杆菌细胞.该载体可应用于油料能源植物种子含油最的遗传改良.