稻瘟病菌链状分生孢子形成突变体的研究

通过三种途径得到了稻瘟病菌产生链状着生分生孢子的突变体菌株，并对这些突变菌株的DNA指纹图谱、致病性及孢子形成等特性与原菌株分别作了比较研究。用复合位点探针MAGGY和MGR586进行的DNA指纹图谱分析结果表明，这些突变体确系野生型稻瘟病菌的突变体。虽然这些突变菌株都能产生病斑，但其致病性较野生型菌株有明显下降。叶鞘接种结果表明，所用突变菌株均能形成附着孢并能穿透寄主细胞壁。突变菌株能形成链状着生的分生孢子，多数有两个分隔，呈弯膝形或长镰刀状，透明或灰橄榄色。突变菌株在病斑上和燕麦片培养基上都能产生链状着生的分生孢子，也能产生正常的分生孢子。通过单孢分离后，在燕麦片培养基上形成的两种孢子的比例基本稳定，表明突变菌株的孢子形成是一种受遗传控制的稳定性状。     

稻瘟病菌粗毒素在水稻稻瘟病中的作用

用稻瘟病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌｏｒｉａ ｏｒｙｚａｅ Ｃａｖ．）非致病性菌系８９－４４－１和致病性菌系８９－１０－３，８９－７－３，８９－４２－３和８９－１２－１的培养过滤液对寄主作毒力测定，研究了粗毒素在水稻稻瘟病害中的作用初步确定瘟病菌粗毒素为致病性因素，在病菌侵入寄主体内时起作用。不同菌系对寄主植物的毒力存在差异，金属元素Ｚｎ、Ｍｎ、Ｆｅ对稻瘟病菌菌丝生长有促进作用。     

Pot2在稻瘟病菌群体结构分析中的应用

利用稻瘟病菌的一段倒位重复序列Ｐｏｔ２设计的一对引物直接对稻瘟病菌的ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。根据带型相似性大于８０％为度可将国际水稻所一个稻瘟病圃上的３１０个菌株划分６个宗亲群（ｌｉｎｅａｇｅ）。这些依分子标记划分的宗亲群与品种的遗传背景有密切关系,而且各宗亲群在水稻不同生育期有不同的波动方式。     

体外施用小分子RNA抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果

[目的]本文旨在分析体外施加靶向细胞色素b(Cytb)的小分子RNA对稻瘟病菌致病性的抑制作用。[方法]将稻瘟病菌与双链小分子RNA(ds-sRNA^MoCytb-21)共同孵育,通过测定孢子萌发效率和形态,确定小分子RNA对稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成有抑制作用。在分别施加溶剂(对照组)或dsRNA^MoCytb-500(处理组)的情况下,使用稻瘟病菌菌株Guy11侵染水稻‘日本晴’,明确体外施加小分子RNA是否可以降低稻瘟病菌的致病能力。[结果]与对照相比,与小分子RNA共同孵育的稻瘟病菌孢子萌发率和附着胞形成率显著降低。2′-O-甲基修饰(OMe)和硫代甲氧基修饰(SOMe)能够延长小分子RNA的抑制效果。用Guy11和dsCytb混合喷施的水稻病斑面积较对照组显著降低。[结论]体外施加特异性靶向稻瘟病菌Cytb的小分子RNA能够抑制稻瘟病菌的致病性,具有开发成为高效绿色环保RNAi药剂的潜力和价值。     

莱氏绿僵菌Nr0815分生孢子在化学农药中的相容性

为明确莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子在常见化学农药中的相容性,室内观察了2种除草剂(68%草甘膦铵盐可溶粒剂、200 g/L百草枯水剂)、3种杀菌剂(75%百菌清可湿性粉剂、80%多菌灵可湿性粉剂、65%代森锌可湿性粉剂)和2种杀虫剂(24%灭多威可溶液剂、20%甲氰菊酯乳油)对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发、菌丝生长和产孢量的影响。结果表明,7种化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发、菌丝生长和产孢量均具有一定的抑制作用,抑制效果表现为杀菌剂杀虫剂除草剂。其中,除草剂以68%草甘膦铵盐可溶粒剂对分生孢子萌发率、菌丝生长抑制率和产孢量的影响最小,在最大推荐使用质量浓度(8 000μg/mL)下,72 h时的孢子萌发率、菌丝生长抑制率和产孢量分别为(22.00±3.40)%、(72.79±2.49)%、(4.93±0.44)×10~8个/mL。除草剂杀菌剂杀虫剂中,莱氏绿僵菌菌株Nr0815分别与68%草甘膦铵盐可溶粒剂、80%多菌灵可湿性粉剂和20%甲氰菊脂乳油的相容性较好。     

四川省稻瘟病菌交配型再研究

用来自法国农业研究所(INRA)的标准菌株KAT3(MAT1-1)和GUY11(MAT1-2)及来自国际水稻研究所(IRRI)的标准菌株2539w(MAT1-1)和6023(MAT1-2)对四川省长期保存的141个稻瘟病菌菌株进行了育性和交配型的测定,利用根据MAT1-1和MAT1-2基因全序列所设计引物5′-TCAGCTCGCCCAAATCAACAAT-3′和5′-ACTCAAGACCCGGCACGAACAT-3′(MAT-1),5′-GAGTTGCCTGCCCGCTTCTG-3′和5′-GGCTTGGTCGTTGGGGATTGT-3′(MAT-2)进行PCR扩增测定交配型,141个菌株可育率经测定为36.17%,其中有27个为MAT1-1,占可育菌株的53%,24个为MAT1-2,占可育菌株的47%;稻瘟病菌株在交配中可起雌性、雄性和两性作用,两性菌株占可育菌株的48.94%;不同品种、采样地点乃至同一田块均病菌群体内均可出现两个交配型。PCR检测结果与对峙培养结果吻合率为75%。     

云南省稻瘟病菌的交配型分布

 对在云南省43个县采集到的1311个稻瘟病菌菌株的有性世代的研究结果表明：（1）在云南省MAT1-2的菌株数量较多，占能形成有性世代菌株数的62.8%；普文县等11个县市MAT1-1和MAT1-2两种交配型的菌株都有分布：而大理等3个县市只分离到MAT1-1交配型，昆明市等13个县市只分离到MAT1-2交配型。（2）云南陆稻上分离的稻瘟病菌中，能形成有性世代的菌株比例较高；有性世代能形成较高的两性菌株也较多。（3）在部分陆稻地块，两种交配型的菌株同时存在，甚至从同一病斑上都可分离到能互相交配的两种交配型的菌株。这些结果预示出云南陆稻植株上产生有性世代的极大可能性。     

不同胁迫因子对稻瘟病菌菌丝形态的影响

以含有红色荧光(细胞核)的稻瘟病菌菌株Guy11-H1:RFP为研究对象,利用激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜在4种胁迫条件下对其生长和菌丝形态进行研究。结果表明,Guy11-H1:RFP在4种胁迫条件下生长变慢;在KCl处理下,菌丝局部不规则膨大,隔膜间距变短,菌丝塌陷;Na Cl处理下,菌丝呈现片段化,塌陷,且2种条件下,细胞核分布均受到影响。H2O2和SDS处理下,菌丝形态不受影响。     

稻瘟病菌分泌蛋白组学研究

稻瘟病菌分泌蛋白在稻瘟病菌入侵水稻过程中发挥重要作用。收集稻瘟病菌(Guy11菌株)液体培养的上清液,富集蛋白,经过烷基、还原处理和酶解后,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对酶解肽段进行分离及鉴定,利用信号肽预测工具SignalP和蛋白质亚细胞定位软件Protcomp对鉴定到的蛋白进行生物信息学预测验证。结果显示,共鉴定出30个稻瘟病菌的分泌蛋白,其中:24个蛋白具有N端信号肽,26个蛋白可分泌到胞外,3个蛋白定位在细胞膜上。对其功能进行分类,发现多数为酶类,参与水解及能量代谢。这些酶类和蛋白的发现与进一步研究,将为揭示稻瘟病菌侵染的机理提供帮助。     

根癌农杆菌介导的遗传转化及其在稻瘟病菌中的应用

根癌农杆菌介导的遗传转化（ATMT）技术是近 20 年发展起来的真菌研究中最具变革性的技术之 一,它作为一种转化工具已被广泛应用于真菌基因功能研究中,使人们对真菌基因组学的理解有了很大的改变。 利用 ATMT 获得随机的 T-DNA 插入突变体库,结合突变体菌株表型筛选,使许多过程的遗传基础得到阐明。 ATMT 法具有操作简单,转化受体广泛,转化效率高以及转化子遗传稳定性高等优势。稻瘟病菌是植物十大重 要真菌之一,是引发水稻稻瘟病的病原真菌。目前,培育水稻抗病品种是控制稻瘟病最经济和环保的方法。通 过克隆稻瘟病菌相关致病基因并研究其功能,在解释致病机理和生理特性,以及培育抗病品种方面具有重要的 理论和实践意义。以根癌农杆菌为介导的遗传转化为稻瘟病菌的插入突变、基因敲除和标记克隆等方面研究提 供了一个重要工具。针对根癌农杆菌介导的遗传转化原理、特点、步骤、影响因素以及该技术在稻瘟病菌功能 基因组学研究中的应用进行综述,以期能够为稻瘟病菌等真菌的遗传转化方面研究提供相关的参考。     

氮胁迫条件下稻瘟病菌菌丝体蛋白质组学研究

采用改进的三氯乙酸/丙酮法,对稻瘟病菌菌丝体蛋白质进行双向电泳,获得了高分辨率电泳图谱,较改进前三氯乙酸/丙酮法蛋白质点数量平均提高687个点。在等电点pI 3～10和4～7范围内,电泳图谱上可分别检测到(500±40)及(984±70)个蛋白点。利用该方法对氮胁迫条件下稻瘟病菌菌丝体蛋白质进行双向电泳,在pI 4～7范围内电泳图谱上检测到(1 169±90)个蛋白点。通过加强对样品的清洗结合丙酮对蛋白质在水化液中的二次沉淀,能较好地除去样品中杂质而保证电泳质量。优化后的方法可用于稻瘟病菌菌丝体蛋白质组的研究,并获得了更加理想的效果。     

湖南省稻瘟病菌无毒基因鉴定

【目的】了解湖南省稻瘟病菌无毒基因组成,为培育水稻新品种及合理布局抗稻瘟病品种提供参考依据。【方法】采用2014年分离自湖南桃江病圃丽江新团黑谷(LTH)上的120个稻瘟病菌单孢菌株室内离体针刺接种于24个已知抗瘟基因的水稻近等基因系(NILs)上,对供试菌株进行无毒基因鉴定。【结果】120个稻瘟病菌含有全部24个无毒基因,在24个无毒基因中,出现频率高于40.00%的有Avr-Pita和Avr-Pish;出现频率在30.00%~40.00%的无毒基因有Avr-Piz、Avr-Piz5、Avr-Pi3和Avr-Pi9;其余无毒基因出现频率均较低,特别是Avr-Piks、Avr-Pikp、Avr-Pib、Avr-Pi12和Avr-Pi11出现频率均低于10.00%。【结论】含抗性基因Pi-ta和Pi-sh的水稻品种可在湖南省推广利用;含抗性基因Pi-z、Pi-z5、 Pi-3和Pi-9的水稻品种在湖南推广时应慎重考虑;含抗性基因Pi-ks、Pi-kp、Pi-b、Pi-12和Pi-11的水稻品种不宜在湖南省推广利用。     

稻瘟病菌一假定几丁质酶在毕赤酵母中的表达

本研究从稻瘟病菌菌株Guy11中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增到一假定几丁质酶基因MGG_08054.6的cDNA序列,将其亚克隆至带有His-tag标签的酵母表达载体pPIC3.5K中,构成重组质粒pPIC3.5K-ws,电击转化至毕赤酵母菌菌株GS115,通过MD-MM平板筛选及PCR验证获得重组酵母转化子GS115-PICH-ws;阳性转化子在甲醇诱导下,成功分泌出重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子质量为48 ku,与其理论计算值基本相符;Ni-NTA法分离纯化后的重组蛋白经DNS法测定具有几丁质酶活性.     

2011年鄂西地区水稻稻瘟病菌遗传多样性的分析

[目的]扩大鄂西地区稻瘟病菌菌库,分析其群体结构.[方法]收集鄂西不同地区2011年间的感病稻秆,分离保存稻秆上的穗颈瘟病菌,通过RAPD、rep-Pot2-PCR、REMAP 3种标记对分离的菌株进行分子标记.[结果]从9个稻秆上共分离得到29个稻瘟病菌.遗传多样性分析结果表明,相似性水平在75％时,2011年供试菌株可分为5个遗传宗谱,宗谱3（7个菌株）和4（19个菌株）为优势宗谱,其余3个为稀有宗谱.[结论] 2011年鄂西地区稻瘟病菌由5个遗传宗谱组成.     

辽宁省稻瘟病菌无毒基因型鉴定及分析

【目的】鉴定稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的无毒基因型,了解无毒基因在不同地区流行菌株中的分布情况,为品种布局提供参考。【方法】根据已经克隆且与稻瘟病菌致病性相关的6个无毒基因序列设计引物,选取辽宁省稻瘟病常发区的26株稻瘟病菌单孢菌株,提取各菌株DNA样本作为模板,进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳及PCR产物测序,对6个无毒基因PCR产物进行碱基和氨基酸序列的分析比较。对琼脂糖凝胶电泳未出条带的,设计不同引物进行验证性试验。【结果】在PCR产物电泳检测中,Avr1-CO39、Avr-pia和Avr-pii没有产物条带,对这3个无毒基因设计验证引物,其PCR产物电泳检测仍没有条带出现,其结果证明辽宁省各水稻主产区流行稻瘟病菌中多不携带Avr1-CO39、Avr-pia和Avr-pii;对于其他3个无毒基因 AvrPiz-t、Avr-pik和Avr-pita则有特异性扩增产物,说明这3个无毒基因在各稻区稻瘟病菌中以不同突变类型及不同频率出现。其中,与Pi2、Pi9和Piz-t对应的AvrPiz-t,分别在22个菌株的中被检测到,且有21个菌株的序列与其序列一致,说明该基因遗传相对稳定,也间接证明携带Pi2、Pi9和Piz-t 的水稻品种在辽宁地区的广谱抗性;与基因组序列不同的16号菌株,在DNA序列192 bp处发生一个单碱基C的缺失,从而导致移码突变,且碱基突变导致氨基酸序列至72位氨基酸时提前终止,而使该基因编码的蛋白质失去无毒基因的功能。与Pik、Pik-p、Pik-m和pik-s对应的Avr-pik,电泳检测结果表明各菌株均有特异性条带出现,经测序验证等位基因序列分为4种类型（B、D、F、G）,其中12个菌株携带可为Pik或其等位基因Pik-m和pik-p所识别的D类型;9个菌株携带B类型,该等位基因曾被报道,但是否具有无毒基因的功能仍未验证;另有2个菌株携带F类型等位基因,该基因为首次发现,并分别出现在丹东和盘锦地区。其特点在于与D类型基因间存在143（A/G）的碱基差异,氨基酸序列翻译结果显示其为错义突变,即48（G/D）;而其余3个菌株携带G类型等位基因,该基因亦属首次发现,且仅出现在抚顺新宾地区,碱基序列与D类型存在168（G/A）的差异,导致翻译提前终止,基因功能丧失。对于Avr-pita,26个菌株特异性扩增产物一致,但测序检测到5种等位基因类型,且均与Avr-pita有差异,碱基序列的变化多导致错义突变。这5种等位基因的氨基酸序列之间差异由3个氨基酸位点的差异所致,分别为83（D/N）、192（Y/C）和207（K/R）,3处突变均在基因结构域范围内,几种等位基因均已见报道。【结论】辽宁稻区流行稻瘟病菌中Avr-pik、AvrPiz-t和Avr-pita分布较为广泛,选育及推广携带相应抗病基因的水稻品种可减轻稻瘟病的危害。     

稻瘟病菌dsRNA病毒筛选及其对寄主的影响

应用纤维素吸附法对60个稻瘟病菌株进行真菌病毒筛选,发现14个菌株含有ds RNA病毒。对带毒菌株GD45通过利巴韦林–高温结合方法得到衍生脱毒菌株GD45–4,与带毒菌株相比,其菌丝更为饱满、菌丝较直,在PDA平板上菌落形态显得更为蓬松,颜色偏白。推测菌株GD45 ds RNA病毒消除后会对其表现型产生一定影响。     

近十年广东稻瘟病菌生理小种变化分析

从2006-2015年近10年间收集的来自广东各地的7225份穗颈瘟样本中分离出稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ）单孢菌株3690个,经接种到中国水稻稻瘟病菌鉴别品种上共鉴定出8群51个生理小种,其中以ZB群、ZC群和ZG群为主要优势种群,而ZB群出现频率最高,为48.44％～75.35％;病菌生理小种以ZB13、ZB15、ZC15、ZC13和ZG1为主要优势小种,其中ZB13出现频率最高,为32.47％．