实时荧光定量PCR方法检测转基因玉米MIR604

转基因玉米MIR604是瑞士先正达公司2005年研发的抗虫玉米,中国于2008年批准MIR604进口作为食品和饲料的加工原料。为了精确定量检测MIR604及其加工产品,在MIR604的左侧边界序列和玉米基因组之间设计引物和探针,成功建立了MIR604品系特异实时荧光定量PCR检测方法。采用该方法设计的引物和探针,对6种非转基因作物、MIR604及其他非目标转基因作物进行检测,除MIR604外,其余样品均未检测到MIR604分子片段的扩增信号;对已知含量为1%的MIR604标准品进行定量检测,测量值为1.07%,接近真实值1%;灵敏度实验结果显示,该方法能检测到仅5个拷贝的MIR604分子片段。该试验所建立的MIR604品系特异实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性、准确度及灵敏度,可用于转基因玉米MIR604的定量检测。     

多重DPO-PCR检测转基因玉米MON810和MIR604体系建立

针对转基因玉米MON810和MIR604品系插入位点序列,分别设计品系特异性DPO引物,建立转基因玉米MON810和MIR604品系检测的多重DPO-PCR方法。结果表明,设计的DPO引物特异性强,灵敏度达0.5 ng/μL,并且对退火温度不敏感。该检测方法特异性强、灵敏度高,适合于对转基因玉米MON810和MIR604品系进行快速检测。     

转基因玉米MON863结构特异定量PCR方法的建立

根据转基因玉米MON863载体构建特异结构,设计引物和Taqman探针,建立了转基因玉米MON863载体构建特异结构定量PCR检测方法,并采用该法定量检测了1％含量的MON863标准品(不确定度为10％).结果显示,采用本文构建的方法获得标准曲线斜率,在-3.6～ -3.1之间,相关系数大于0.99,扩增效率为105.436％,在90％～110％的范围内.待检样品的定量检测结果(1.08％)非常接近真实值(1％,不确定度为10％),表明本文建立的转基因玉米MON863结构特异定量PCR检测重复性好,灵敏度和准确度高,可以在日常检验中推广应用.     

转基因玉米NK603结构特异定量PCR方法的建立

根据转基因玉米NK603载体构建特异序列,设计引物和Taqman探针,建立了转基因玉米NK603载体构建特异结构定量PCR检测方法,并采用该法检测了2％含量的NK603标准品(不确定度为10％).结果显示,采用本文构建的方法获得的标准曲线斜率,在-3.6- -3.1之间,相关系数大于0.99,扩增效率为98.1％,在90％～110％的范围内.样品检测结果(1.6％)接近已知含量(2％,不确定度为10％).表明本文建立的转基因玉米NK603结构特异定量PCR检测方法,可以在日常检验中推广应用.     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度

[目的]对实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度进行评定。[方法]使用转基因玉米MON863结构特异实时定量PCR方法测定含量为1%的转基因玉米MON863样品（CRM）中结构特异片段的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定测量的不确定度。[结果]研究得到uA=1.7×10^-2,uB=9.0×10^-4,uC=1.7×10^-2,U95=0.036,测量结果为1.08%±0.036。[结论]转基因玉米MON863结构特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度

[目的]对实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度进行评定。[方法]使用转基因玉米MON863结构特异实时定量PCR方法测定含量为1%的转基因玉米MON863样品（CRM）中结构特异片段的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定测量的不确定度。[结果]研究得到uA=1.7×10-2,uB=9.0×10-4,uC=1.7×10-2,U95=0.036,测量结果为1.08%±0.036。[结论]转基因玉米MON863结构特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。     

用实时荧光PCR方法定量检测Bt176转基因玉米

以实时荧光PCR技术鉴定商业化种植的转基因玉米Bt176品系。根据转基因玉米Bt176中内源基因Zein和外源基因cry1Ab设计引物及TaqMan荧光探针,成功建立了检测转基因玉米Bt176品系的实时荧光PCR方法。结果表明,应用实时荧光PCR方法检测转基因作物,不仅可以达到品系鉴定的作用,而且可以用于转基因成分的检测。该方法简便迅速,降低了污染机会,为转基因作物及产品的品系检测提供了新方法。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON88017

为完善中国转基因生物及产品定量分析标准化技术体系,保障中国生物安全和降低生态风险,本研究建立了转基因玉米MON88017及产品的实时荧光定量PCR分析方法,并用特异性、准确度、灵敏度以及测量不确定度等指标评价了该方法。结果显示该方法分析转基因玉米MON88017特异性很强;29次重复测量含量为1.50%的转基因玉米MON88017样品,平均测量值(1.541%)接近真实值(1.50%),相对偏差为2.70%,测量值的变异系数为0.110 4,回收率为100.00%,测量不确定度为0.096;在97.5%的置信水平下能检测到最低含量为5个拷贝的MON88017分子片段。因此,本研究建立的转基因玉米MON88017实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确度和灵敏度,能为中国转基因生物安全监管提供良好的技术支撑。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米NK603结构特异基因的测量不确定度研究

应用四川省农业科学院分析测试中心实验室建立的转基因玉米NK603结构特异实时定量PCR方法测定含量为2％的转基因玉米NK603样品中结构特异片段的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定了测量的不确定度.结果表明,uA =0.0003,uB=0.001,uC=0.001,U95 =0.002,测量结果为1.6％±0.002％.NK603结构特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应.     

实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用

实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。随着转基因产品大规模商业化,转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点,使RQ-PCR逐步成为转基因检测的重要工具。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米Bt176测量不确定度分析

应用实时定量PCR方法测定样品中转基因玉米Bt176的含量,并从多个方面来分析测量的不确定度。结果显示,A类不确定度为0.0003,B类不确定度为0.0007,合成不确定度为0.001,有效自由度veff为272,包含概率P为95%,扩展不确定度U=0.002,测量结果为(0.8±0.2)%。不确定度评估结果表明,测量不确定度的主要来源是微量液体转移量的偏差。     

棉花中转基因成分多重PCR检测体系的建立

以棉花内源基因sad1、报告基因GUS、外源抗虫基因Cry1 Ab/Ac、筛选基因NPTⅡ、NOS终止子和CaMV35 S启动子为检测对象,设计的6对引物能扩增长度合适的基因片段且避免了引物二聚体。通过优化PCR扩增体系中不同引物终浓度的配比以及退火温度对多重PCR检测的影响,建立了棉花转基因成分6重PCR检测体系。结果表明:采用本研究建立的棉籽基因组DNA提取方法,该6重PCR检测体系能够有效地从少至1颗棉籽的少量样品里检测出棉花中的转基因成分。     

水稻种子样品前处理对转基因成分荧光PCR检测的影响

以转基因水稻科丰6号不同含量的水稻种子为样品,对影响检测结果的主要前处理措施,包括样品研磨颗粒细度与DNA提取过程中样品CTAB裂解缓冲液温育时间等,进行分析筛选.结果表明,样品颗粒细度与CTAB缓冲液温育时间的不同处理组合对提取的DNA含量影响极显著,其中,样品颗粒细度100目与CTAB缓冲液温育时间8 h(过夜)处理的样品DNA提取效果与荧光PCR检测结果均最佳.采用最佳前处理组合,样品的主要转基因成分(Ca MV 35S、NOS、Cry1Ab)检出限从通常的转基因含量质量分数0.01%降到0.001%,使得水稻种子转基因成分荧光PCR检测灵敏度提高10倍,大幅度提高了检测结果的准确性.     

布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]根据DNA序列数据库上已公布的布鲁氏菌外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)Omp 25基因,设计一对引物和荧光探针,通过反应体系优化,建立一种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法.[方法]以构建的外膜蛋白目的片段重组质粒为标准品,验证该方法的灵敏度、特异性,通过优化反应条件,建立标准曲线.通过对34份已知临床背景的样品检测,验证该方法的敏感性.[结果]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,特异性验证符合率100％,最低检测限约为100 copies/μL,敏感度的检出率为100％,建立标准曲线的R2为0.994,扩增效率99.73％.[结论]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于布鲁氏菌的检测.     

实时定量PCR在植物真菌病原体定量检测中的应用

实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR)凭借其特异性强、定量准确和速度快等优点已经成为快速检测和研究植物真菌病害的重要工具。文章就这项技术在植物真菌病原菌定性和定量检测、土壤栖息的植物真菌病原体和寄主组织中真菌DNA的定量检测等方面的应用研究进行了综述。大量研究表明,快速发展的实时定量PCR技术正在开创一个植物真菌病害的诊断学、传染病学和寄主-病原体相互作用研究的新领域。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.     

转基因食品PCR定性检测的研究进展

以靶序列的选择、DNA提取和产物的检测为主线,概括了PCR(PolymeraseChainReaction,PCR)在定性检测基因修饰有机体(Geneticallymodifiedorganisms,GMOs)中的应用,指出了存在的问题以及未来的发展方向。     

猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2）,是感染猪Sus scrofa domestica的一种单链DNA病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法,对于PCV2感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计了荧光定量聚合酶链式反应（PCR）引物,利用SYBR Green作为荧光染料建立了一种定量检测PCV2的PCR方法。结果表明:该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,每微升的最低检测限低至101拷贝DNA。利用该方法对34份PCV2阳性临床样本进行检测,检测符合率为100%,明显高于普通PCR方法的50.0%。因此,本研究建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法为该疾病的预防和控制提供一种有效的检测工具。图4表4参26     

木尔坦棉花曲叶病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法

【目的】木尔坦棉花曲叶病毒Cotton Leaf Curl Multan Virus（CLCuMV）是为害锦葵科植物的重要双生病毒之一,本研究的目的是建立CLCuMV定量检测方法,为进一步研究其在寄主植物内的增殖动态、在介体昆虫内循环和其与寄主、介体间互作机制提供技术手段.【方法】 以纯化的含CLCuMV基因组的质粒为模板,利用 SYBR Green I 荧光定量 PCR对不同浓度的质粒样品进行CLCuMV扩增,制作标准曲线.依照建立的标准曲线,计算烟粉虱Bemisia tabaci及朱槿Hibiscus rosa-sinensis中CLCuMV的含量.【结果和结论】 该定量检测法可检测到低浓度（5.2×10¹ μL^-1)的CLCuMV,其灵敏度是常规PCR的10倍,可被用于在寄主植物和介体昆虫体内CLCuMV的定量检测.