小麦籽粒休眠Vp1-B1基因的等位变异检测与分离

Vp1基因是控制籽粒休眠性的重要基因之一,检测该基因的等位变异类型,可以进一步理解籽粒休眠以及穗发芽抗性的遗传控制机理.本文根据GenBank中小麦Vp1-B1基因序列设计特异引物检测我国小麦微核心种质以及地方品种和推广品种,结果表明,本研究除了发现已报道的3种等位变异类型,分别为Vp1-B1a、Vp1-B1b和Vp1-B1c,另外检测到一种新的变异类型,暂命名为Vp1-B1x.经改良的变性PAGE凝胶电泳检测以及序列比对分析表明,Vp1-B1x与Vp1-B1c基因的序列相似性最高,达99%;其在第3内含子区域发生"ATAT"4个碱基的插入以及4个SNP,但是该等位类型在所检测的品种中分布较少,其与籽粒休眠水平及穗发芽抗性之间的关系尚待进一步验证.     

小麦穗发芽抗性的4个分子标记有效性检验

为筛选出适宜黄淮麦区和长江中下游麦区种植的抗穗发芽白粒小麦品种或种质资源,以36份黄淮麦区和长江中下游麦区的主要品种（系）及地方品种为研究对象,对已报道的4个与穗发芽抗性相关的分子标记：Vp1B3、Xgwm155、Xgwm269和Xbarc170进行有效性验证。测定参试材料种子萌发指数（GI）,并用上述4种标记进行PCR扩增,对扩增条带进行统计分析。结果表明,GI值显示,红粒品种（GI均值为5.1%）明显较白粒品种（GI均值为28.0%）低;4种标记扩增出的带型中仅Vp1B3的845 bp片段能有效地区分36份小麦品种(系);GI值筛选出6份抗穗发芽品种（系）中,其中3份为Vp1B3标记鉴定,可作为黄淮麦区和长江中下游麦区小麦穗发芽抗性育种中首选基因资源。     

我国小麦主推品种穗发芽抗性鉴定及相关分子标记的评价

为了培育抗穗发芽品种,对我国10个小麦主产省份的75个品种进行了穗发芽抗性鉴定,同时利用3个分子标记Vp1B3、Xbarc310和Barc294对上述品种进行了分子检测。结果表明,不同品种间穗发芽抗性存在明显差异。Vp1基因的等位变异与穗发芽抗性关系不密切,Vp1B3标记难以用于品种的穗发芽抗性筛选。主效QTL(QPhs-3AS)与种子休眠关系密切,Xbarc310和Barc294可作为穗发芽抗性选择的重要参考,且Barc294较Xbarc310的选择效果好。上述结果为抗穗发芽小麦品种的改良和推广提供了重要信息。     

黄淮麦区(南片)小麦穗发芽抗性评价及其等位基因检测

为了解黄淮麦区(南片)当前小麦穗发芽抗性以及等位基因的分布情况,本研究以94份黄淮麦区(南片)小麦新品系为供试材料,利用种子发芽指数法对供试材料的穗发芽抗性进行评价,同时利用功能标记Vp1B3和Dorm-1对供试材料Vp1B和Dorm-B1位点等位基因进行检测。结果表明,供试材料发芽指数(GI)总体平均值为39.6%,标准差为18.08,变幅为9.62%～88.48%,这批供试材料的穗发芽抗性以中感型为主;在Vp1B位点,共检测到Vp1Ba和Vp1Bc两种等位基因,分布频率分别为64.89%和35.11%,携带等位基因Vp1Ba材料的发芽指数(GI)显著高于Vp1Bc等位基因(P<0.05),等位基因Vp1Bc与抗穗发芽相关,等位基因VP-1Ba与感穗发芽相关;在Dorm-B1位点,仅检测到Dorm-B1a等位基因,这批供试材料Dorm-B1位点的多态性较为单一。本研究能够为黄淮麦区(南片)小麦穗发芽分子改良提供参考信息。     

四个小麦抗穗发芽分子抗性标记有效性的验证与评价

成熟期穗发芽是一种世界性灾害, 严重影响小麦品质和产量。本试验利用已报道的4个与穗发芽抗性相关的标记, 即STS标记MST101、STMS标记wmc104、QTL位点Xgwm155与Vp1B3, 结合穗发芽率分析,对95份中国小麦地方品种和历史品种的穗发芽抗性进行筛选, 旨在从中筛选出抗穗发芽品种, 并对这4个分子标记的有效性进行比较, 筛选出可用于种质资源筛选和分子标记辅助育种的高效分子标记。结果表明, Vp1B3和Xgwm155与穗发芽抗性相关, 而MST101和wmc104与穗发芽抗性无关。比较而言, Vp1B3更能有效地用于筛选穗发芽抗性品种, 但将Vp1B3和Xgwm155结合起来筛选抗穗发芽小麦品种, 会提高选择效率。     

对冬小麦品种穗发芽抗性的初步研究

１９９２～１９９５年用室内保湿法对１５００份小麦材料进行穗发芽抗性鉴定，从小麦穗上发芽与收获后的种子发芽的比较把小麦收获前穗发芽分为低、中、高３种敏感型；白粒品种穗发芽抗性低于红粒品种；数量遗传分析表明，小麦穗发芽率的广义遗传力高于６０％。     

分子标记Tamyb10D和TaDFR-B的有效性验证及对小麦抗穗发芽基因型的筛选

为了比较与小麦穗发芽抗性相关分子标记的有效性以及在白粒小麦品种中筛选出抗穗发芽的基因型材料,选择已报道的2个与穗发芽抗性相关的标记Tamyb10D和Ta DFR-B,对2套白粒小麦试材(78,103份)的穗发芽抗性进行综合筛选。结果表明:标记Tamyb10D可有效地用于白粒小麦穗发芽抗性筛选,而标记Ta DFR-B不适用于白粒小麦品种(系)材料的穗发芽抗性筛选的鉴定。通过分子标记Tamyb10D的筛选结果和发芽指数的评价,结合以前用分子标记Vp1B3的检测结果,在103份试材中筛选出5份具有高抗穗发芽基因型材料(GI10%),分别是:阆中白麦子、万县白麦子、陪陵须须白麦、川362和小白玉花,其单倍型分别是:Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bb、Tamyb10D/Vp-1Bc;在另外一套(78份)试材中筛选出10份具高抗有穗发芽基因型材料(GI10%),分别为西农6028、克群、百农3217、开封124、郑州742、西昌5762、小偃5号、克壮、许跃6号和武农99,其单倍型均为Tamyb10D/Vp-1Bc。     

四川省小麦品种(系)穗发芽抗性评价

穗发芽严重影响小麦产量和品质,受到生长环境、种皮颜色和遗传基因的共同控制。由于四川地区在小麦收获季节容易出现高温高湿的气候条件,是小麦穗发芽的常发和重发区。依据材料的穗发芽抗性,有目的性地配制杂交组合选育抗性品种是控制小麦穗发芽的重要策略,而系统鉴定分析各优良品种及品系的穗发芽抗性是亲本选配的重要依据。本研究调查分析了242份2000年来四川省审定小麦品种及即将成为未来几年新品种的2017—2018 年四川省区试品系的田间穗发芽情况,发现分别有23(9.5%)和67 (27.7%)份材料具有强（穗发芽率低于5%）和高（穗发芽率介于5%~15%）的穗发芽抗性。这为穗发芽抗性育种亲本的选择提供了参考;并且发现穗发芽抗性在不同类型材料中存在差异：2000 年来审定品种＜区试普通小麦品系＜区试早播早熟小麦品系＜区试特殊用途小麦品系,穗发芽抗性在未来几年品种中将有所增强;种皮颜色对穗发芽抗性具有强烈影响,随着种皮颜色加深,穗发芽抗性越强,但仍发现3 份（‘川育26’、‘川辐9 号’、‘川辐17 号’）白皮小麦材料具有强的穗发芽抗性,为白皮小麦抗穗发芽育种提供参考。其次发现在四川环境下,早播可能会提高小麦品种的穗发芽抗性。     

西南地区87份小麦品种(系)穗发芽抗性的分子鉴定及筛选

小麦穗发芽使小麦的产量大幅度降低,严重影响小麦的加工品质,而西南麦区一直是小麦穗发芽的重发区。为了在历史小麦品种(系)中鉴定出抗穗发芽的种质材料,本研究以来自西南麦区的87份小麦主推品种及后备品系为研究材料,利用PM19、Vp1B3两种抗穗发芽候选基因进行分子标记,为抗穗发芽育种提供种质资源。结果表明,在87份小麦中有4份含有PM-19A1a基因,分别是科成4号、兴0217、蜀麦1763、SW 1747;有9份含有Vp-1Bb基因,分别是黔麦0504、16092、绵麦303、内麦366、川麦604、BL 5002、BL 6007、2017 P 4-2、SW 1747。     

两淮麦区小麦品种穗发芽敏感性研究

对两淮麦区40年来代表性小麦品种穗发芽敏感性进行了全面研究，主要结果是：（1）黄熟期的培养皿种子发芽、水层纸巾穗发芽、延期收获田间穗发芽调查和α－淀汾酶活性测定等方法对鉴别小麦品种穗发芽敏感性都有显著的效果；（2）经改进的水层纸巾7天穗发芽度试验是简便、有效、功能全面和适用性好的鉴定方法；（3）小麦品种穗发芽敏感性有4种类型：种子深休眠的低敏型、种子浅休眠与其它机制联合作用的低敏型、种子浅休眠的中敏型和无任何保护机制的高敏型；（4）低敏型和中敏型都有红、白皮两类品种，高敏型全是白皮品种；（5）红色种皮除有助于种子休眠外，还有延缓和减轻田间穗发芽的效应；（6）、1980年代以来的小麦品种抗穗发芽性有严重退化趋势，抗性品种只占12．5％，而50－70年代的供试品种有81．8％是抗穗发芽的；（7）就其重要性，抗穗发芽育种的地位不应低于抗病育种，应改善沿淮、淮北小麦品种布局，重视选择推广红皮品种；（8）小麦抗穗发芽育种选择指标─黄熟期7天穗发芽度；高抗＜1．15、中抗＜1．70；（9）推荐红皮品种博爱7023和马场2号、白皮品种丰产3号和百农3217为小麦抗穗发芽鉴定试验的标准品种。     

小麦穗发芽抗性相关Vp1基因启动子的分离及功能验证

成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质。Vp1是调节胚发育, 促进胚成熟和休眠的重要转录因子, 对小麦种子休眠和穗发芽抗性具有重要作用。本研究分离了普通小麦B基因组Vp1基因的启动子, 生物信息学预测结果表明, 其含有9个脱落酸响应元件ABRE、2个DREB和6个MYB干旱响应元件、3个赤霉素响应元件GARE、1个水杨酸响应元件TCA-E、2个茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、4个SKn-1和1个RYREPE胚乳特异表达元件。采用5′端缺失的方法, 构建了系列含Vp1启动子不同区段融合GUS报告基因的瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪转化小麦愈伤组织, 瞬时表达结果显示, Vp1启动子在无诱导的情况下不能启动GUS基因表达, 在低温、ABA、GA、PEG和NaCl诱导后可以启动GUS基因表达, 表现诱导表达特性, 且其诱导表达强度随启动子缺失片段长度变短而减弱。利用Gateway方法成功构建了6个启动子各缺失片段类型的植物表达载体, 并通过农杆菌介导转化四倍体小麦Stewart, 获得转基因植株。该启动子可有效启动GUS基因在转基因植株的花药、糊粉层、穗轴及根中表达, 其他组织中没有表达。当启动子片段大于660 bp时, 外源ABA可诱导启动子启动GUS基因在转基因植株茎节中的表达。     

Vp1 expression profiles during kernel development in six genotypes of wheat, triticale and rye

During the last few decades, the physiological and genetic background of dormancy, and correlated pre-harvest sprouting (PHS) have been intensively investigated. Special attention has often been paid to genetic factors that may explain and predict PHS susceptible behaviour. A major candidate is the Vp1 gene which is involved in embryo development and maturation as well as in dormancy establishment. In this study, Vp1 gene expression during kernel development was studied in wheat, triticale and rye as a potential biomarker for selecting PHS tolerant varieties in cereal breeding programs. Plants of known PHS tolerant and PHS susceptible varieties were grown under controlled conditions from flowering until harvest ripeness. During that period, kernels were regularly harvested for RNA extraction and cDNA synthesis. Calibrated and normalized relative Vp1 expression levels were obtained in an RT-qPCR assay. During kernel development, Vp1 expression levels generally showed a typical peak during the soft dough stage, after which they decreased and remained low until harvest maturity. Differences in Vp1 expression levels could be observed between the PHS susceptible and PHS tolerant varieties of wheat, with the PHS tolerant variety showing higher levels of relative Vp1 expression compared to the PHS susceptible variety. In triticale, however, this difference was only seen once and could not be confirmed in further experiments. It seems that the Vp1 gene in triticale behaves in a similar way as in rye, in which no specific trends could be observed.     

The use of <Emphasis Type="Italic">Vp1</Emphasis> in real time RT-PCR to select for pre-harvest sprouting tolerance in triticale

In spite of the availability of laboratory and field tests there is still a major problem to select pre-harvest sprouting (PHS) tolerant triticale varieties in a reliable, field-independent way. One approach to minimize the influence of environmental conditions and physio-morphological traits on PHS detection is using molecular genetic tools. The ‘viviparous’ Vp1 gene has been repeatedly described to play an important role in dormancy in wheat. A quantitative RT-PCR assay based on the expression of the Vp1 gene has been developed. Specific primers were designed for detecting Vp1 in both wheat and triticale. The expression levels of Vp1 were normalized using reference genes and relatively quantified with the comparative C_t-method. However, the first results indicate that the achieved Vp1 expression levels at 50 days post anthesis are not useful to select for PHS tolerance, both in wheat and triticale. This negative outcome so far is possibly due to the existence of several splicing events or to the late assaying moment in the kernel development, when Vp1 expression is found to be low.     

中国小麦微核心种质及地方品种籽粒休眠特性的分子标记鉴定

为探索我国小麦微核心种质及地方品种籽粒休眠的遗传基础,利用已报道的4个3AS上的SSR标记(Xbarc57、Xbarc294、Xbarc310和Xbarc321)和1个3BL上的Viviparous-1基因标记Vp1-b2对107份我国小麦微核心种质及31份地方品种进行籽粒休眠的分子标记鉴定。结果表明,5个分子标记在试验材料中表现出丰富的等位变异,具有5～6种等位类型,与籽粒萌芽指数(GI)密切相关。根据一般线性模型分析结果,各位点的等位变异显著影响籽粒休眠,其中Vp1-b2和Xbarc294对籽粒休眠作用较其他标记大,可分别解释65.8%和61.2%的表型变异;其次是Xbarc310(56.3%)和Xbarc57(55.8%),最小的是Xbarc321(53.3%)。而5个标记联合可解释95.9%的性状变异,其次是Vp1-b2和Xbarc294的组合(89.1%),解释变异最小的标记组合是Vp1-b2和Xbarc321(79.4%)。5个分子标记即可解释籽粒休眠的绝大部分表型变异,说明我国小麦微核心种质及地方品种籽粒休眠特性受3AS和3BL上的2个主效基因控制。     

中国小麦微核心种质低分子量麦谷蛋白Glu-A3位点等位基因的PCR检测

低分子量麦谷蛋白在麦谷蛋白中约占75%,对小麦品质具有重要的作用。目前对LMW-GS组成与小麦品质的关系尚无统一的、标准的、综合的结论,中国小麦LMW-GS的分布现状尚很少研究。本研究利用7对低分子量麦谷蛋白Glu-A3位点等位基因的特异引物标记,对200份中国小麦微核心种质的Glu-A3位点的分布状况进行PCR分析,结果表明:中国微核心种质中以c、a、d三个等位亚基的品种数目为多,近一半的品种含Glu-A3c,1/4的品种含Glu-A3a,14.5%的品种含Glu-A3d,三者占总品种数的85%。含Glu-A3b和Glu-A3e的品种各占5%左右,含Glu-A3f的只占1%,因此,对面筋强度作用较大的b、d亚基的数目较少,而对面筋强度作用最小的c亚基却占44.5%。可见通过调整LMW-GS亚基的组成将是改良我国小麦品质的一条重要的途径。