橡胶树胶乳紫色酸性磷酸酶基因克隆及表达分析

为了探究橡胶树胶乳中紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase,PAP)与乙烯刺激增产关联情况.从橡胶树胶乳中鉴定得到9条具有完整保守序列的紫色酸性磷酸酶基因序列,具紫色酸性磷酸酶保守结构域特征.9条序列与木薯、白杨亲缘关系较近,分别属于三类PAP家族,除HbPAP3外均属于高分子量蛋白,蛋白预测定...     

紫色酸性磷酸酶在植物响应低磷胁迫中的作用研究进展

紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase,PAPs)属于酸性磷酸酶(APases)的一种,在酸性条件下能有效地将酸酐、磷酸酯等有机磷催化水解为植物能够直接吸收利用的无机磷.低磷胁迫下根系增强紫色酸性磷酸酶的合成和分泌,是植物适应低磷胁迫的重要机制之一,也是磷高效利用型植物的典型特征.PAPs在不同...     

甘蓝乙二醛酶基因家族的鉴定与表达分析

乙二醛酶(glyoxalase, GLY)是植物应对醛酮类有害物质胁迫的重要酶,对于植物应对非生物胁迫有重要意义。本研究从甘蓝数据库中鉴定获得了15个BolGLYI和16个BolGLYII,利用生物信息学方法系统分析了这些GLY基因的染色体定位、基因结构、蛋白的等电点、分子量、进化关系、保守基序,以及组织表达模式。结果表明,BolGLYI在染色体分布很集中,而BolGLYII的分布比较分散;甘蓝两类GLY基因家族都分成5个亚群,且其与拟南芥的亲缘关系比和水稻更近;同源关系越近的BolGLY基因,其基因结构和保守基序都更相似;BolGLYI家族的基因成员组织表达差异较大,在逆境条件下BolGLYI07和BolGLYI13基因表达量显著高于BolGLYI家族的其他基因,而BolGLYII的各个家族成员在各组织的表达差异不明显,在磷和锌元素胁迫条件下BolGLYII01基因和BolGLYII09基因表达显著高于其他基因,以上结果为进一步研究BolGLY基因的功能提供了理论基础。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14启动子克隆与功能分析

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14受低磷诱导表达,其超表达显著提高植物有机磷利用效率,为进一步探究其调控机制,本研究以GmPAP14cDNA序列检索大豆参考基因组,获取基因上游启动子序列,设计引物克隆了中黄15 GmPAP14启动子序列。利用PLACE与PlantCARE预测启动子调控元件发现,该序列中含有增强子调控元件、组织特异表达元件,根特异表达元件、转录因子PHR1结合的PIBS元件等。构建了GmPAP14启动子3个5’端缺失片段融合GUS的植物表达载体PGmPAP14-2568-GUS、PGmPAP14-2238-GUS、PGmPAP14-1635-GUS,并通过Floraldip法获得转基因拟南芥。利用GUS染色和活性测定分析GmPAP14启动子不同片段表达活性发现,正常磷条件下各片段转基因拟南芥均在根尖表达,低磷条件下GUS染色可扩展到成熟区和根毛,另外转PGmPAP14-2238-GUS植株的GUS活性最高。这些结果为后续的基因调控研究奠定重要基础。     

NaCl胁迫对甘蓝、白菜和油菜种子萌发的影响

为研究蔬菜种子吸收或外排Na+能力与其耐盐性的关系,采用非损伤微测技术检测了628甘蓝、青杂中丰白菜、苏州青油菜、茼蒿、上海鸡毛菜种子外Na+流速的动态变化.结果表明,在10mmol/L NaCl溶液处理下,甘蓝和茼蒿种子外排Na+,而白菜、油菜和鸡毛菜种子吸收Na+,其中,甘蓝、白菜和油菜种子对Na+吸收或外排的效果明显.随后以甘蓝、白菜和油菜种子为材料,在不同NaCl浓度下对种子萌发进行了实验,结果表明,随着NaCl浓度升高,甘蓝、白菜和油菜种子的发芽率、相对发芽率、发芽势和发芽指数都呈明显下降趋势.当NaCl浓度达到300mmol/L时,甘蓝、白菜和油菜种子的发芽率分别为37.33％、14.67％和10.00％,耐盐半致死浓度分别为323.73,241.68mmol/L和200mmol/L.初步说明种子可以通过增加Na+的外排,减弱高浓度Na+对种子的毒害作用.     

甘蓝型油菜紫色酸性磷酸酶基因BnPAP17＿A05的克隆及遗传转化

磷是植物生长发育的必需元素之一,紫色酸性磷酸酶能够参与植物体内有机磷的降解,在油菜抗低磷胁迫中具有潜在的应用价值。本研究从甘蓝型油菜中克隆获得编码紫色酸性磷酸酶的基因BnPAP17＿A05,生物信息学分析发现该基因具有3个外显子和两个内含子,编码含有337个氨基酸的蛋白质,且该蛋白质在第7～29个氨基酸的位置有一个跨膜结构域。本研究构建了过表达载体2X35S::BnPAP17＿A05,并成功完成在甘蓝型油菜中的遗传转化,获得了11个转基因阳性株系,为深入研究BnPAP17＿A05在油菜抗低磷胁迫中的作用提供材料,也为油菜抗低磷胁迫的分子育种提供一定理论基础和实践意义。     

白菜HSP90基因家族的鉴定及表达分析

本研究为了深入研究白菜(Brassica rapa)热激蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)家族基因在温度胁迫下的响应机理及相关功能,利用生物信息学的方法对白菜HSP90基因家族成员进行了鉴定,同时分析了这些家族成员的理化性质、基因结构、进化关系、染色体分布、启动子元件以及表达模式。结果表明：白菜中至少含有14个HSP90基因,氨基酸长度在490～820之间,呈酸性,分布于10条染色体上,含有1～19个不等的内含子,10个保守基序;基于系统进化树分析,将14个基因分为5个簇;顺式作用元件分析得到7个响应温度胁迫基因;荧光定量分析表明这些基因在温度胁迫下存在显著差异,表明这些基因广泛参与温度胁迫响应。本研究为后续白菜HSP90基因功能挖掘提供科学参考。     

两种同时提取小麦根腐离蠕孢菌DNA和RNA的方法比较

获得足够数量和高质量的RNA和DNA是进行分子生物学研究工作的基础。以小麦根腐离蠕孢菌为原料,分别采用溶菌酶法和液氮研磨法破碎真菌细胞壁提取DNA,用琼脂糖凝胶电泳、紫外吸收及聚合酶链式反应（PCR）技术进行核酸完整性和纯度检测。结果表明：两种方法在提取DNA时都同时得到了高质量的RNA;PCR检测结果表明DNA完整性比较高,两种方法得到的DNA质量相当;溶菌酶法中得到的RNA质量优于液氮法。利用溶菌酶破壁法提取小麦根腐离蠕孢菌DNA的提取体系可用于RNA的提取,为小麦根腐离蠕孢菌核酸的DNA和RNA的同时提取提供了一种简便、安全、可行的方法。     

双角山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的克隆及生物信息学分析

通过对双角山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的核酸和氨基酸序列进行相关生物信息学分析,旨在进一步利用基因工程手段将Ae Bi PAP1基因转入到小麦中,为获得耐低磷胁迫能力增强的小麦品种提供种质基因。以双角山羊草叶片为材料,根据小麦中的PAP1基因和二穗短柄草的PAP1基因设计兼并引物,采用同源克隆的方法,获得了双角山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的c DNA序列,并将其命名为Ae Bi PAP1,该双角山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因长1.124 kb,共编码335个氨基酸,相应的氨基酸分子量为38.131 k Da,等电点为5.77。与小麦中的PAP1基因相比,双角山羊草PAP1的c DNA编码区发生碱基替代的地方共有35处,包含13处颠换与22处转换,有15处编码的氨基酸残基不同,其序列一致性达95.52%。对Ae Bi PAP1基因编码的蛋白质进行生物信息学分析发现,该蛋白具有一个信号肽但却没有跨膜结构,对Ae Bi PAP1编码蛋白进行三级结构预测发现,该编码蛋白包含金属离子结合中心,预测它属于金属蛋白。因此,将其定位于质膜比分泌到胞外的概率要高,通过对同源蛋白质氨基酸序列进行系统进化树分析,结果表明,双角山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因与普通小麦的亲缘关系最近,与粳稻、短柄草、谷子亲缘关系较近,与大麦、乌拉尔图小麦、水稻以及节节麦等植物的亲缘关系较远。     

Homoeological relationships between the f chromosome of Brassica rapa and the e chromosome of Brassica oleracea

Eight plants of the putative double monosomic addition line (DMAL, 2n= 20) were developed by crossing a monosomic chromosome addition line of radish [f(A)‐type monosomic addition line (MAL) (2n= 19)] carrying the f chromosome of Brassica rapa (2n= 20, AA) with another [e(C)‐type MAL (2n= 19)] having the echromosome of Brassica oleracea (2n= 18, CC). The homoeological relationships between the two alien chromosomes were investigated by morphological, cytogenetic and random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Seventeen morphological traits that were not present in the radish cv. ‘Shogoin’ were observed in both MALs and these traits were substantially exhibited in DMAL plants. At the first metaphase of pollen mother cells (PMCs), the two parental MALs showed a chromosome configuration of 9II +1I, demonstrating impossibility of recombination between the R and the added chromosomes. The DMALs formed 10II in approximately 73% of PMCs, with one bivalent showing loose pairing between two chromosomes differing in size. In an attempt to identify the two MALs by RAPD‐specific markers using 26 selected random primers, 13 and 20 bands were specific for the f(A)‐type and the e(C)‐type MALs, respectively; 12 bands were common to both MALs (26.7%). In conclusion, the f chromosome of B. rapa is homoeologous to the e chromosome of B. oleracea. The genetic domain (genes) for 17 morphological traits are linked to each homoeologous chromosome bearing 27% of the corresponding RAPD markers.     

津田芜菁泛素化相关蛋白基因BrRUB1的克隆及表达分析

RUB1(related to ubiquitin 1)是植物和酵母中一种泛素类似蛋白质,是Cullin家族的一个成员。为阐释津田芜菁Br RUB1基因的表达特性,本研究克隆了津田芜菁RUB1基因的全长c DNA序列,命名为Br RUB1,Gen Bank登录号为KF501173。其ORF全长471 bp,编码156个氨基酸;亚细胞定位结果显示,Br RUB1-GFP定位于细胞核,表明Br RUB1蛋白可能在细胞核中发挥其功能。q RT-PCR检测Br RUB1的表达表明,该基因表达量在花蕾中最高,花瓣中次之,具有组织特异性。而且Br RUB1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。     

利用异源六倍体(A~rA~rA~nA~nC~nC~n)与甘蓝种间杂交合成甘蓝型油菜的新方法

利用亲本种的遗传变异是改良油菜的重要途径,本研究提出一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的新方法。以甘蓝型油菜(AnAnCnCn)品种中双11号为母本,与白菜型油菜(ArAr)品系SWU07杂交,经染色体加倍获得异源六倍体(ArArAnAnCnCn),再与甘蓝(CoCo)杂交,创建出具有亲本种遗传成分的新型甘蓝型油菜(ArAnCnCo)。该六倍体连续3个世代核型稳定,各世代中的自交和自由授粉结实率无显著差异,花粉育性在94.6%～98.8%之间,3个世代自交平均结实率为每角果5.47粒,自由授粉平均结实率为每角果7.93粒;各世代六倍体(ArArAnAnCnCn)与不同类型甘蓝杂交平均结实率分别为每角果0.05、0.04、0.05粒,世代间无显著差异,且六倍体与栽培、野生甘蓝杂交结实性无显著差异,可交配性不受六倍体世代及甘蓝类型的影响。尽管该六倍体与甘蓝可交配性较低,但仍可在田间条件下成功杂交,获得新型甘蓝型油菜(ArAnCnCo),表明以ArArAnAnCnCn六倍体为桥梁与甘蓝杂交,是一种有效导入甘蓝遗传成分、创建新型甘蓝型油菜的新方法。     

津田芜菁泛素结合酶BrUBC11基因的克隆及表达分析

为阐释津田芜菁Br UBC11基因的表达特性,克隆了津田芜菁UBC11基因的全长c DNA序列,命名为Br UBC11,Gen Bank登录号为KM396887。其c DNA全长685 bp,ORF区全长447 bp,编码148个氨基酸的开放阅读框;亚细胞定位结果显示,Br UBC11-GFP定位于细胞核内,表明Br UBC11蛋白可能在细胞核中发挥其功能。荧光定量PCR检测Br UBC11在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在花瓣中表达量最高,花蕾中次之,具有组织特异性。而且Br UBC11在芜菁白色根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。研究结果显示,在芜菁中,UBC11属于多功能基因,具有潜在的参与花发育和UV-A信号转导相关途径的功能。     

Combination of resistance to Verticillium longisporum from zero erucic acid Brassica oleracea and oilseed Brassica rapa genotypes in resynthesized rapeseed (Brassica napus) lines

Resynthesized (RS) forms of rapeseed (Brassica napus L.; genome AACC, 2n = 38) generated from interspecific hybridization between suitable genotypes of its diploid progenitors Brassica rapa L. (syn. campestris; genome AA, 2n = 20) and Brassica oleracea L. (CC, 2n = 18) represent a potentially useful resource to introduce resistance against the fungal pathogen Verticillium longisporum into the gene pool of oilseed rape. Numerous cabbage (B. oleracea) accessions are known with resistance to V. longisporum; however, B. oleracea generally has high levels of erucic acid and glucosinolates in the seed, which reduces the suitability of resulting RS rapeseed lines for oilseed rape breeding. In this study resistance against V. longisporum was identified in the cabbage accession Kashirka 202 (B. oleracea convar. capitata), a zero erucic acid mutant, and RS rapeseed lines were generated by crossing the resistant genotype with two spring turnip rape accessions (B. rapa ssp. olerifera) with zero erucic acid. One of the resulting zero erucic acid RS rapeseed lines was found to have a high level of resistance to V. longisporum compared with both parental accessions and with B. napus controls. A number of other zero erucic acid RS lines showed resistance levels comparable to the parental accessions. In the most resistant RS lines the resistance and zero erucic acid traits were combined with variable seed glucosinolate contents. Erucic acid‐free RS rapeseed with moderate seed glucosinolate content represents an ideal basic material for introgression of quantitative V. longisporum resistance derived from B. oleracea and B. rapa into elite oilseed rape breeding lines.     

结球甘蓝类钙调素蛋白基因BoCML39的克隆与表达分析

类钙调素蛋白作为钙调素蛋白的家族之一,调控植物生长发育、激素调控、病原菌防御及各种胁迫.本研究以结球甘蓝为试验材料,通过克隆获得BoCML39基因,其开放阅读框(ORF)为510 bp,编码169个氨基酸,不含内含子.预测BoCML39蛋白分子量为19.25 kD,等电点为4.35,为亲水蛋白,含有4个EF-hand结...     

甘蓝BoPINs家族基因的特征和表达分析

为了探索植物生长素极性运输载体蛋白编码基因BoPINs家族参与甘蓝自交不亲和性的成员数目与参与方式,本文通过转录组分析获得BoPINs家族在甘蓝自花和异花授粉后的表达情况,利用分子生物学技术和生物信息学方法对该家族的基因结构、蛋白进化亲缘关系和表达模式等特征进行分析。结果表明,甘蓝BoPINs基因家族包含8个成员,含有5~9个外显子和4~8个内含子;其编码的蛋白质的氨基酸残基数在350~650之间,相对分子质量为38~70kD;除了BoPIN5和BoPIN8不含中间亲水区以外,其余6个BoPINs家族成员都含有位于两端的疏水区和中间亲水环,它们可能以膜锚定蛋白的形式发挥作用;甘蓝BoPINs与芜菁BrPINs、拟南芥AtPINs基因家族亲缘关系较近;染色体定位分析表明,BoPIN1-1、BoPIN3-1、BoPIN3-2和BoPIN6与S位点之间发生不同程度的连锁;启动子活性分析表明,BoPINs家族蛋白参与甘蓝SI反应,可能受IAA、ABA等激素相互交叉影响;BoPIN1-1、BoPIN1-2、BoPIN2、BoPIN3-1、BoPIN3-2、BoPIN4、BoPIN6、BoPIN7-1和BoPIN7-2在柱头中表达量均较高;数据表达谱和荧光定量分析表明,8个家族成员中的6个BoPINs基因在自花授粉后下调表达;自花授粉后柱头生长素含量降低,与SI反应呈负相关。因此,在甘蓝BoPINs家族的8个成员中有6个BoPINs基因家族成员可能在膜上以负调节方式调控自交不亲和反应。     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

白菜型冬油菜类甜蛋白的筛选、克隆及其在低温胁迫下的表达

类甜蛋白是一种能在低温胁迫下诱导表达,增强植物抗逆性的关键蛋白质。本研究运用双向电泳结合质谱技术,筛选低温胁迫下陇油7号叶片差异蛋白点,从中分离出与抗寒密切相关的类甜蛋白。根据已发表植物类甜蛋白基因TLP的保守序列设计引物,采用RT-PCR扩增陇油7号的DNA,获得TLP基因开放阅读框,长度为732 bp,编码243个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,与甘蓝型油菜(Brassica napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达99.18%,该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的GH69-TLP-SF超家族,TLP相对分子质量和理论等电点分别为26.02 k D和9.15。TLP含有一个信号肽,为亲水性蛋白,亚细胞定位预测其是在内质网中合成的蛋白。二级结构预测表明陇油7号的TLP是由不规则卷曲和延伸链组成的不稳定蛋白。实时荧光定量和半定量分析显示,在适当阈值的低温胁迫下TLP基因表达量上调,表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。     

甘蓝枯萎病抗性基因FOC1序列分析及抗性相关变异位点分析

旨在发掘甘蓝抗枯萎病基因FOC1中与抗性相关的特异性单核苷酸多态性(SNP),为进一步开发FOC1特异分子标记提供理论依据。在对11份甘蓝自交系材料枯萎病抗病表型鉴定基础上,通过基因测序,对每份材料中FOC1等位基因及相应的氨基酸序列变异进行分析。结果表明,FOC1等位基因序列之间共存在92处SNP变异和2处Indel变异,其中包含C381A/G等18个在抗、感材料中表现出特异性差异的SNPs。此18个特异的SNP中转换型比率为86.11%、颠换型比率为13.89%,4种碱基变异率以T/C、G/A最高,分别占47.22%和38.89%,而C/G和A/C变异率共占13.89%。本研究也发现抗、感材料中存在4个特异的SNP,可造成3个氨基酸的变化。