秋子梨等九个品种S基因型的鉴定

根据梨S基因高度保守区设计兼并引物,对各秋子梨品种的基因组进行S基因特异性扩增、连接、转化并测序,GenBank中比较后确定各品种的S基因型.9个供试品种的S基因型分别为:秋子梨中的'寒香'为S36Sx,'苹香'为S1S31,'南果梨'为S34S34,'金香水'为S1Si,'延边大香水'为S31S36,'寒红'为S27S34,'小香水'为S29S34,'花盖王'为S31S31S34S34,白梨中的'锦丰'为S19S34.     

梨20个品种S基因型的鉴定及新S-RNases基因克隆

 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的S基因型,应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,鉴定了20个梨品种和野生类型个体的S基因型。起源于我国的'奥连'(S_pS₃₂)、'吊蛋'(S_dS_e)、'沙疙瘩'（S₃₆S_d）品种和杏叶梨的一个类型（S₂₂S_c）个体中存在西洋梨的S-RNase基因,证明S-RNase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋子梨的'麦梨'、'内蒙古山梨'中发现了2个新S-RNases基因,命名为S₄₀-、S₄₁-RNase（DQ903313、DQ988687）。S₄₀-和S₄₁-RNase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属S₁₁-和S₆-RNase的同源性为100%和94.4%,这表明S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。     

8个中国梨品种S基因型的分子鉴定

为鉴定8个中国梨品种的S基因型,使用梨自交不亲和基因(S-RNase)特异引物"FTQQYQ"和"anti-ⅡWP-NV",对8个梨品种的基因组DNA进行特异扩增,并对扩增片段进行回收、克隆、测序。使用生物信息学软件对各序列分析和经同源性搜索分析后,确定了各品种的S基因型。结果分别是:兰州花长把为S19S22,青面为S1S18,黄面为S1S12,早蜜为S19S29,大面黄为S1S19,无子黄为S28S16,大青皮为S34S19及金锤子为S16S19。     

4个枇杷品种S基因型鉴定及新基因S_(31)-RNase序列分析

【目的】鉴定‘黄密’、‘贵妃’、‘早红’和‘软条白沙’4个枇杷品种的S基因型,为其生产栽培合理选择授粉树及杂交育种亲本选择提供科学依据。【方法】以苹果S基因高度保守区设计兼并引物对4个品种的基因组DNA进行PCR扩增,片段回收、克隆及测序,分别采用Blast软件和Bioedit软件进行同源性检索和结构分析。【结果】从参试的4个品种中共分离了4个S等位基因,分别为S2、S5、S6和S31,其中S31-RNase为新分离的枇杷S-RNase基因,Gen Bank登录号为:KC131133。所克隆获得的4个枇杷S-RNase基因均克隆到4个保守区(C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV),具有与苹果S基因相同的氨基酸序列结构。【结论】确定了参试4个枇杷品种S基因型分别为:‘贵妃’S2-S6、‘黄密’S2-S5、‘早红’S5-S6、‘软条白沙’S6-S31。     

11个延边地区栽培梨品种的S基因型鉴定

鉴定梨品种的S基因型可为合理配置授粉树、杂交亲本选配提供理论依据。为鉴定11个延边地区栽培梨品种的S基因型,利用梨的自交不亲和基因（S-RNase）特异引物FTQQYQ和anti-IIWPNV,对11个梨品种的基因组DNA进行S基因特异扩增,并对扩增片段进行回收、克隆、测序,使用生物信息学软件对各序列进行分析和同源性搜...     

八月酥等14个梨品种自交不亲和基因(S基因)型的鉴定

多数梨品种自花授粉不结实,生产上要合理配置授粉品种才能获得应有的产量。鉴定梨品种的S基因型,能为梨园合理配置授粉品种提供依据。以我国育成的梨品种为试材,利用特异引物PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及DNA序列分析,鉴定出了14个梨品种的自交不亲和基因型(S基因型),并通过统计部分品种的田间人工授粉的坐果率以及应用荧光显微镜观察异花授粉后花柱内的花粉管生长情况来验证鉴定出的梨品种S基因型的可靠性。这些品种的S基因型为:八月酥S3S16、绿云S3S29、谢花甜S29S34、香茌S1S21、脆绿S3S4、新雅S4S34、雅青S4S34、伊犁红句句S22S28、猪嘴酥S19S22、假直把子S5S19、青魁S1S3、德胜香S3S29、张掖长把S3S29、金坠梨S21S34。     

12个梨品种S基因型的鉴定

应用PCR扩增技术, 根据目的S基因与GenBank中已知S 基因同源性100%原理鉴定了我国育成的12个梨品种的S基因型, 分别是: ‘红酥脆’为S₄S₃₆ , ‘新梨7号’为S₂₈S_d , ‘金水3号’为S₅S₂₉ , ‘八月酥’为S₃S₁₆ , ‘金水1号’为S₃S₂₉ , ‘龙泉酥’为S₃S₂₂ , ‘雪花’为S₄S₁₆ , ‘雪芳’为S₄S₁₆ ,‘雅青’为S₄S₃₄ , ‘新雅’为S₄S₃₄ , ‘德胜香’为S₃S₂₉ , ‘富源黄’为S₁₆S₃₃。通过对S基因的DNA序列分析, 确认S₁₆、S₃₁为同一S基因。本研究结果丰富了我国梨品种的S基因型信息, 为田间合理配置授粉品种提供了依据。     

20个苹果品种的S基因型鉴定

以‘富士’、‘华瑞’、‘华硕’和‘华星’等20个苹果品种为材料,利用S等位基因高度保守氨基酸序列FTQQYQ和anti-1/MIWPNV设计的S基因通用引物,以及S等位基因多态性序列设计的19对特异引物,PCR扩增、测序以鉴定20个品种的S基因型;并用‘华瑞’和‘华硕’分别与‘美八’、‘锦秀红’、‘华冠’和‘富士’进行授粉试验验证S基因型的准确性。PCR结果表明:通用引物扩增S等位基因时,仅‘富士’、‘华瑞’、‘华硕’、‘华星’、‘美八’和‘红脆宝’6个品种有效地扩增出2条特异的S等位基因条带,其S基因型有S1S_9、S_9S_(24)、S_5S_9和S_5S_(24)等4种;19对特异引物扩增S等位基因时,‘华帅’等14个品种扩增得到2条特异性条带,S基因型有S_(10)S_(19)、s_2s_3、s_2S_5、s_3S_(10)、s_2S_9、S_5S_(24)、S_9S_(10)、s_3S_(10)和S_5S_9等9种。因此,20个苹果品种的S基因型分别为:‘富士’S1S_9,‘华瑞’和‘华硕’S_9S_(24),‘华星’、‘美八’和‘红珍珠’S_5S_9,‘红脆宝’、‘华玉’和‘99-1-29’S_5S_(24),‘华帅’S_(10)S_(19),‘金玉’s_2s_3,‘早红’、‘华美’和‘嘎拉’s_2S_5,‘Seokwang’s_3S_(10),‘锦秀红’、‘蜜玉’和‘华冠’s_2S_9,‘绿佳’S_9S_(10),‘信浓红’s_3S_(10)。2015和2016年‘华瑞’与‘华硕’的正反交组合坐果率较低(低于15.52%);而‘华瑞’和‘华硕’分别与‘美八’、‘锦秀红’和‘华冠’、‘富士’品种的正反交组合坐果率较高(高于46.30%)。因此,本试验中相同S基因型的授粉组合其坐果率较低,不同S基因型的授粉组合其坐果率较高,授粉试验支持S基因型鉴定结果。     

白梨品种4个新S基因的分离与鉴定

利用S_1-8-RNase氨基酸保守序列‘FTQQYQ’和‘IIWPNV’设计兼并引物, 对白梨4个品种冬黄、新梨一号、红皮酥和博山池的基因组DNA进行PCR扩增。PCR产物限制性酶切分析显示: 新梨一号和冬黄各含有一个S₈ - 等位基因。DNA序列测定和生物信息学分析表明, 这4个品种中含有与已报道的S_1-19等位基因有差异的S基因, 经分析鉴定为新的S 等位基因, 分别命名为S₂₀ - 、S₂₂ - 、S₂₆ - 、S₂₇ - 等位基因(GenBank登录号分别为: AY250988、AY250990、AY339396、AY339397) 。冬黄、新梨一号、红皮酥和博山池的S基因型分别为S₈ S₂₀、S₈ S₂₂、S₁₂ S₂₆和S₁₉ S₂₇。     

槜李等15个李品种S基因型鉴定及其多态性分析

利用李属S-RNase基因特异性引物,对15个供试李品种进行PCR扩增,共获得30个目的条带。对这些目的条带进行测序鉴定出15个李品种的S基因型。通过与NCBI中利用BLASTn与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB等数据库中的序列比对,结果表明,其中9个为新S-RNases基因,对9个新S-RNases核苷酸序列进行分析发现,位于高变区内的内含子大小为141～1758bp,其同源性为33.9%(S-18～S-19)～81.6%(S-20～S-21),表现出丰富的长度和序列多态性;编码区的核苷酸序列比对结果,其同源性为73.3%(S-16～S-19)～91.7%(S-17～S-22);其推导氨基酸序列相似性为67.3%(S-16～S-19)～89.1%(S-17～S-22);包含李属S-RNase一级结构所共有的C2、C3保守区和高变区(RHV)。系统进化分析表明,9个新S-RNases与李属其它树种S-RNases聚类在一起,归属为李亚科(Prunoideae)。     

新高系梨10个品种S基因型的鉴定

以亲缘关系极近的新高系梨10个品种及被视为‘新高’亲本的‘天之川’和‘今村秋’梨等为试验材料,对其基因组DNA进行了PCR-RFLP检测、DNA序列测定及生物信息学分析。结果表明：新高系梨10个品种即‘新高’、‘黄金’、‘水晶’、‘早生黄金’、‘早蜜新高’、‘天皇’、‘金秋’、‘晚大新高’、‘农家新高’和‘鲜黄’的S基因型分别为S₃S₉、S₃S₄、S₃S₉、S₃S₄、S₃S₉、S₃S₉、S₃S₉、S₃S₉、S₃S₉和S₃S₅;‘天之川’、‘今村秋’的S基因型分别为S₁S₉和S₁S₆,通过基因型判定‘今村秋’非‘新高’梨的父本。     

梨自交不亲和强度不同品种花柱S糖蛋白含量的差异

 提取梨( Pyrus) 自交不亲和强度不同品种花柱可溶性蛋白质, 应用等电聚焦电泳法在凝胶板上分离出S 糖蛋白, 用图像解析法进行定量。结果表明, 花柱总S 糖蛋白含量因品种而异, 自交不亲和强、弱及自交亲和的品种每1 􀀁g 花柱可溶性蛋白中含总S 糖蛋白分别为􀀂1. 3 ng 、0. 7 ~ 0. 9 ng、 0. 7 ng 。不同的S 基因所表达的S 糖蛋白量差异显著, 即使是同一S 基因所对应的S 糖蛋白量也因品种而异。     

雪花梨及其亲缘品种S基因型的确定

梨是典型的自交不亲和性果树,自然授粉结实率低,品质差。通过确定梨品种S基因型可寻找简便快速克服自交不亲和性,提高产量,改良品质的方法。根据梨S基因的一级结构特点,利用S基因的保守序列设计特异引物,并对雪花梨及其亲缘品种的基因组DNA进行PCR扩增。将基因组特异扩增电泳只显示一条S基因带雪花梨的特异扩增片段回收并与T载体连接,转化至大肠杆菌中。取其中1个阳性克隆进行测序,并通过生物信息学软件分析确定其核苷酸序列,推导出氨基酸序列,经网上Blast比较,确定该雪花梨S基因片段的S基因型,然后就该S基因进行酶切系统分析,有针对性地挑取另一个阳性克隆测序分析。另外,通过品种间的亲缘关系并经过酶切检测以分析雪花梨亲缘品种的S基因型,并确定各品种的S基因型分别为:雪花S4S16、冀蜜S1S16、雪青S3S16、雪峰S4S16、雪英S3S16、雪芳S4S16。     

‘金坠梨’自交亲和性突变机制的初步研究

 自交不亲和性品种鸭梨的芽变品种‘金坠梨’自花授粉能结实, 但其自交亲和性突变机制至今不祥。本研究结果表明, 鸭梨自花授粉结实率仅2% , 自花花粉管在花柱中上部已经停止生长, 而金坠梨自花授粉结实率高达76% , 自花的花粉管能正常生长至花柱基部; 鸭梨花柱能够接受金坠梨花粉并受精结实, 而金坠梨花柱却与鸭梨花粉杂交不亲和; 进一步鉴定出了鸭梨和金坠梨基于S-RNase基因的S基因型, 发现两者S基因型相同, 均为S₂₁S₃₄ ; 通过克隆两品种S-RNase基因cDNA全长序列并进行比较分析发现, 该两品种的1对雌蕊S-RNase基因在核苷酸序列上完全相同, 且S-RNase基因均正常表达, 表达量没有明显差异, 从分子水平上证实了金坠梨在花柱方面和鸭梨并无差异, 可能是花粉S 基因发生突变, 导致了自交不亲和性功能的丧失, 表现出自花授粉能够结实。     

‘奥嗄二十世纪’梨自交亲和性分子机制及遗传特性研究

 ‘奥嗄二十世纪’是自交不亲和性梨品种'二十世纪'的自交亲和性花柱突变体,花粉自交不亲和性功能正常,其自交亲和性突变的分子机制及遗传特性目前仍有争议。本研究通过田间自花及相互授粉以及基因组、mRNA转录和蛋白质水平比较,分析‘奥嗄二十世纪’、‘二十世纪’及其后代S-RNase基因的存在与否、表达特性及其在后代中的遗传。结果显示,‘奥嗄二十世纪’花柱S₂-RNase基因的核苷酸序列和表达特性与其原始品种‘二十世纪’的完全一样;而S4-RNase基因信号比其原始品种‘二十世纪’的弱,而且也在花柱中正常表达(包括转录和翻译水平),但表达量低;然而在其自交亲和后代基因组中检测不到S₄-RNase基因。本研究表明,‘奥嗄二十世纪’基因组中存在花柱S₄-RNase基因,但不能遗传给后代。