转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定

利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶双价基因导入小麦品种扬麦10号和Bobwhite,共得到了13株T0代转基因植株,2个小麦品种的转化效率分别为1.4%和1.0%.T1代植株赤霉病抗性鉴定结果表明,转基因植株对赤霉病具有一定抗性,小穗发病率4.76%～11.76%,低于抗病对照和感病对照.T1代植株分子检测结果表明,外源基因分离比例为2.33∶1,较低的分离比例可能与外源基因的丢失有关.     

转几丁质酶和b-1,3-葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定

利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和b-1，3-葡聚糖酶双价基因导入小麦品种扬麦10号和Bobwhite，共得到了13棵T0代转基因植株，2个小麦品种的转化效率分别为1.4%和1.0%。T1代植株赤霉病抗性鉴定结果表明，转基因植株对赤霉病具有一定抗性，小穗发病率4.76%～11.76%，低于抗病对照和感病对照。T1代植株分子检测结果表明，外源基     

抗玉米丝黑穗病转基因株系的分子检测及抗病株系选育

采用花粉介导方法将质粒pGL II_RC_1导入玉米自交系海92_1中,获得了T0种子128粒,种子经潮霉素抗性筛选得到抗潮霉素植株16株。对抗性植株分离的统计分析表明,多数情况下几丁质酶基因以单拷贝形式导入转基因植株,后代分离比约为3∶1。抗性苗移栽到大田后,5~6叶期取样进行PCR扩增、PCR Southern blot杂交分析,对T1的分析结果表明,几丁质酶基因已导入转基因植物细胞中。对T2,T3植株的检测结果显示,目的基因已整合到转化植株基因组中并可随植株世代稳定遗传。田间抗病鉴定结果表明,转基因植株及后代的玉米丝黑穗病发病率明显比对照降低。根据分子检测及田间抗病鉴定结果,得到GH05024,GH05028 2个抗丝黑穗病的纯合转基因株系。     

导入Chi-linker-Glu和Bar基因获得抗真菌和抗除草剂的转基因烟草

构建重组表达载体pBIb-CG(含有Chi-linker-Glu融合基因和Bar基因),利用农杆菌介导法将其携带的Chi-linke1r-Glu融合基因和Bar基因转化烟草(Nicotiana tobaccum L.)品种红花大金子.经根癌农杆菌侵染和共培养后,用100mg/L Kar+500mg/L Cef筛选抗性芽,获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37％;分别对抗性再生植株中Chi-linker-Glu融合基因和Bar基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90％.PCR、Southern杂交结果证明,外源基因已整合到烟草基因组中.离体抑菌试验和除草剂抗性试验表明,转基因烟草植株对木霉菌(Tricho derma viride)、镰刀菌(Fusarium solanif sppisii)和除草剂都表现出一定的抗性.     

获得抗稻瘟病和纹枯病的转多基因水稻

将多个抗真菌病基因连同筛选基因hpt一起导入一水稻品种中，共获得49个独立的整合有1～4个抗真菌病基因的转基因植株系。转基因植株中几丁质酶的酶活均高于非转化对照植株，且转多个几丁质酶基因或与β-1，3-葡聚糖酶基因一起的转基因植株较转单个几丁质酶基因的植株有更高的酶活性。抗病试验表明，这些不同组合的R2代转基因     

菜豆几丁质酶基因转化马铃薯及后代表达

通过农杆菌侵染和原生质体直接转化法把菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯加工品种大西洋中,获得了13株转化后代,经过PCR分析和Southern blot分析,在5株后代中扩增出900bp目标带,说明菜豆几丁质酶基因已整合到马铃薯四倍体基因组中。RT-PCR分析结果表明,其中的3株叶片中有菜豆几丁质酶基因的表达,而且抗病试验进一步证明了该基因在叶片中有较强的表达强度,转基因植株的抗病性比对照提高了30%以上。     

转Cry2A基因抗虫甘蔗植株的培育

Bt基因具有广谱杀虫性,培育转基因抗虫品种为甘蔗病虫害防治提供了新思路。为了检验Cry2A基因对甘蔗螟虫的防治效果,本研究构建了由玉米Ubi启动子驱动的Cry2A基因高效植物表达载体Cry2A-3300,利用农杆菌介导技术,对甘蔗胚性愈伤组织材料进行遗传转化,经过筛选培养及再生培养共得到46株抗性植株。对抗性植株进行PCR扩增检测,15株呈阳性;进一步利用RT-PCR,表明外源基因Cry2A在转录水平上得到有效表达。室内抗虫鉴定的结果表明Cry2A基因可有效抑制害虫的生长,这将有利于后期进行田间防治。     

Ri质粒介导双价抗真菌病基因转化番茄的初步研究

以番茄新品种T431、1911、0701为材料,以9天苗龄的叶片为受体,通过农杆菌Ri质粒介导,将几丁质酶基因和?-1,3葡聚糖酶基因转化番茄。共获得再生植株100株,经PCR技术检测,导入几丁质酶基因和?-1,3葡聚糖酶基因的植株分别为27株和13株,转化率为27% 和13%;两个目的基因同时导入的植株10株,转化率为10%。PCR-Southern检测呈阳性,表明外源基因已经整合到番茄基因组中。对9株双转化的植株进行RT-PCR检测,几丁质酶基因和?-1,3葡聚糖酶基因的阳性植株分别为5株和4株,证明转化的基因已表达。     

农杆菌介导蔗糖:蔗糖果糖基转移酶基因转化甘蔗

甘蔗是高产高蔗糖型植物的代表,把蔗糖:蔗糖果糖基转移酶基因(1-SST)转入甘蔗并使其得到有效的表达,可将甘蔗中的蔗糖转化成果聚糖.本研究以甘蔗为受体,首先接种甘蔗愈伤,培养20 d后即为胚性愈伤组织,用农杆菌菌液浸染转化.研究结果表明,出芽时PPT的最佳筛选浓度为2.0 mg/L,生根时PPT的最佳筛选浓度为5.0 mg/L.共获得42株抗性植株,对抗性植株进行PCR鉴定,其中26株呈阳性,随机选取3株阳性片段进行测序,与目的基因片段一致,初步证明1-SST基因已经转入甘蔗.     

农杆菌介导法将β—1，3-葡聚糖酶基因导入油菜

菌核病是油菜生产中的主要病害，目前通过常规育种的方式还未寻找到合适的抗源，因此利用生物技术手段将外源抗病基因导入油菜已成为必然趋势。Grison等人将几丁质酶基因导入油菜中，表现出对菌核病的明显抗性。目前利用葡聚糖酶基因已对烟草进行了转化，表达此基因的转基因植株对黑胫病、赤星病及根腐病均有一定抗性，但将此基因导入油菜还未见报道。     

病毒复制酶基因介导玉米抗矮花叶病的研究

本研究将病毒复制酶基因(NIa、NIb)通过花粉介导法,转入玉米优良自交系中.对所转化的玉米后代进行了PCR检测,并对检测呈阳性的植株于次年播种于试验田,对转化的植株连续2代(T1和T2代)利用人工摩擦接种矮花叶病毒的方法进行田间抗病试验.将连续2代抗病的植株通过PCR以及PCR-Southern Blot检测结果证明:病毒复制酶基因已成功导入玉米自交系中,结合田间抗性鉴定,获得了对玉米矮花叶病抗病性增强且农艺性状良好的玉米株系.     

不同遗传类群甘蔗黑穗病菌分离物与甘蔗互作防御酶差异的研究

为研究来源于不同遗传类群甘蔗黑穗病菌分离物侵染寄主甘蔗防御酶活性变化差异,采用注射接种法,将5个不同遗传类群的代表分离物(分离物编号依次为16,24,25,47,89号)侵染抗病甘蔗品种Q171和感病甘蔗品种ROC22,测定甘蔗与甘蔗黑穗病菌分离物互作过程中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)的活性变化。结果表明:5株分离物侵染引起的寄主甘蔗SOD、POD、CAT活性变化曲线中均存在2个酶峰值,抗病甘蔗品种Q171中PPO和感病甘蔗品种ROC22中PAL也存在2个酶峰值,接种后1 d出现峰值Ⅰ,接种后3~5 d出现峰值Ⅱ。其中峰值Ⅱ时期,5株分离物侵染的甘蔗上述5种防御酶活性均高于对照,但不同分离物侵染的甘蔗SOD、POD、PAL活性的峰值Ⅱ大小及出现时间表现出差异,尤其是89号分离物峰值Ⅱ比其余4个分离物峰值Ⅱ出现时间提早1~2 d且峰值差异明显。初步认为89号分离物可能代表着与其他分离物不同的致病型生理小种。     

几丁质酶基因克隆及其野生蕉转化

本研究根据GenBank公布的木霉几丁质酶基因(chitinase)序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从木霉(Trichoderma spp.)中克隆获得了几丁质酶基因全序列,编码区共1275bp,推测其编码424个氨基酸,该基因与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的内切几丁质酶基因chit42(GenBank accession No.L14614)具有99%的同源性。在此基础上,将获得的几丁质酶基因从pGEM-T载体中用XbaⅠ和BamHⅠ切下,克隆到pBI121植物表达载体的XbaⅠ和BamHⅠ位点,构建了植物表达载体pBI-chit并将其转入根癌农杆菌菌株EHA105。该菌株转化野生蕉(Musa itinerans Cheesm.)胚性细胞悬浮系,经过抗性筛选、胚的诱导和萌发,获得成熟体细胞胚和再生苗。通过GUS组织化学法检测和PCR方法鉴定,结果表明外源基因已经成功转入到野生蕉中。本研究为下一阶段转化香蕉栽培品种和筛选抗香蕉枯萎病新种质奠定一定的基础。     

病毒复制酶基因Nib8和ERF转录因子W17基因枪法共转化小麦

将对小麦黄花叶病毒表现高抗的复制酶基因Nib8和具有广谱抗病性的ERF基因W17分别构建到单子叶高效组成型表达载体上,采用基因枪共转化法转化到小麦品种扬麦12和扬麦16中,PCR检测共获得Nib8基因的阳性转基因植株42株,W17基因的阳性转基因植株48株,及两个功能基因均为阳性的转基因植株6株。以扬麦12为受体的转化率分别为1.53%(Nib8)、4.87%(W17)和0.42%(Nib8+W17);以扬麦16为受体的转化率分别为2.05%(Nib8)、0.86%(W17)和0.20%(Nib8+W17)。对两个功能基因都呈阳性的6个植株进行Southern blotting分析,进一步证实功能基因已经整合到小麦基因组中。本研究为获得具有综合抗病性的小麦新材料奠定了基础。     

狼尾草农杆菌转化体系的优化和转基因植株的获得

以狼尾草[Pennisetum alopecuroides (L) Spreng.]愈伤组织为遗传转化受体,利用农杆菌介导法导入黑麦草抗冻蛋白基因LpAFP,初步建立了狼尾草的遗传转化体系,获得了转化植株并利用PCR对14株抗性植株进行初步检测,检测呈阳性的有2株,PCR阳性转化率为14.28％;对2株阳性狼尾草进行RT-PCR检测,2株狼尾草RNA均进行了逆转录,对抗性植株进行了进一步的筛选.结果表明,LpAFP基因已整合到狼尾草基因组中.     

利用斑茅cDNA芯片研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基因差异表达

为了解甘蔗抗黑穗病的分子机制,利用斑茅干旱胁迫cDNA芯片检测了甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达。经杂交,在cDNA芯片的3 860个模板中,有效差异表达(Ratio值≥2.0或≤0.5)的基因为101个,其中上调55个,下调46个。部分基因的定量PCR验证表明,芯片杂交结果可靠。上调表达基因经测序、冗余序列剔除,一共获得36个unique ESTs。已知功能的22个上调表达基因,涉及多条生理代谢途径,如光合作用、离子转运和核酸代谢途径;以及多种分子水平的进程,如基因转录、蛋白质合成与修饰以及细胞信号转导等。另外,还检测到14个未知功能基因。结果表明,甘蔗对黑穗病的抗性具有复杂的机制。本研究为解释甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达及其网络构建奠定了基础,还可以为今后系统研究甘蔗对生物与非生物胁迫的响应机制提供技术支持。     

利用花粉管通道法将查尔酮合酶基因导入仙客来

查尔酮合酶(chalcone synthase—A,CHSA)是花色素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达的量可能影响花的颜色。本项目从矮牵牛(Petunia hybrida)特定发育阶段的花瓣的cDNA中,克隆到查尔酮合酶基因CHSA,插入到含有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的植物中间表达载体pBI12l和pWM101中,首次通过原位生殖系统导入法(具体采用花粉管通道法)转化仙客来,成功地得到4400余粒仙客来转化种子,8株白花植株的个别花瓣出现了黄斑或略显黄色,甚至个别花瓣变成了黄色花瓣：3株白花植株的个别花瓣一半变成了桃红色(二乔),甚至整个花朵完全变成了桃红色。转基因仙客来经PCR检测呈阳性。     

基于花粉介导法转化的玉米自交系抗病植株的获得

【研究目的】将几丁质酶基因导入玉米自交系,获得抗玉米丝黑穗病的转基因植株。【方法】采用花粉介导法进行转化,获得的种子及后代植株检测方法包括：潮霉素抗性筛选、PCR扩增、Southern blot杂交分析以及田间抗病鉴定。【结果】通过转化获得种子43粒,对种子进行潮霉素抗性筛选得到9株抗潮霉素植株;经PCR检测,Southern blot杂交分析得到5株转基因植株。田间抗病鉴定结果显示,转基因植株或株系的丝黑穗病抗性提高1～2级。【结论】花粉介导法转化玉米自交系是获得抗病育种材料的一条快捷、有效的途径。     

利用农杆菌介导法将查尔酮合酶基因导入大岩桐

本项研究通过植物基因工程技术,以改变花色为目的,对花卉进行遗传改良,以期产生新的花色品种,来改变现有花卉花色单一、品种缺乏的现状,丰富我市花卉品种资源。在应用转基因技术进行定向改良花色的研究中用的最多也最成功的基因就是:查尔酮合酶基因。查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS)是花色素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达的量可能影响花的颜色。本项目以查尔酮合酶(Chalconesyn-thase,CHS)基因作为目的基因,以大岩桐为研究对象。具体从矮牵牛(Petuniahybrida)特定发育阶段的花瓣的cDNA中,克隆到查尔酮合酶基因CHSA,进行质粒的重组后,插入到含有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的植物中间表达载体中pBI121中,转化农杆菌LBA4404。通过农杆菌介导法(之叶盘法)遗传转化大岩桐,具体过程如下:农杆菌LBA4404pBI121chsA的培养→农杆菌与大岩桐叶盘共培养→脱菌筛选→抗性芽的扩繁与继代培养→抗性株的生根筛选→移栽成活。经过研究,成功地得到大岩桐转化植株,其中8个株系的转基因植株经PCR检测呈阳性,证明外源基因已整合进入受体植物。有一株玫红品系植株的花瓣上出现了白色的不规则斑点。     

基因枪介导法向小麦导入黄花叶病毒复制酶基因的研究

筛选出适宜小麦转化的优良基因型扬麦158和扬麦10号.以扬麦158幼胚愈伤组织为受体,利用基因枪介导法将含有小麦黄花叶病毒复制酶基因(WYMV-Nib8)的pubiNib8质粒转入了小麦.T0代经PCR扩增分析,获得了14株含WYMV-Nib8基因的转化植株,转化率为0.43%.T1、T2代跟踪分子检测和T2代田间病毒抗性鉴定结果表明,获得了4个抗WYMV的转基因