苜蓿遗传转化的研究进展

综述苜蓿遗传转化研究中,再生体系构建及基因导入方法的研究进展.     

苜蓿遗传转化的研究进展

综述苜蓿遗传转化研究中,再生体系构建及基因导入方法的研究进展。     

蒺藜苜蓿子叶节高频再生系统的建立

通过直接的芽器官发生途径,建立了蒺藜苜蓿Medicago truncatula子叶节外植体的高频植株再生体系.选用在高达5 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)的种子萌发培养基上生长3 d的蒺藜苜蓿幼苗,制备获得由1片子叶和半个胚轴组成的子叶节外植体.以SH培养基为基本培养基,对不同浓度α-萘乙酸(NAA)和6-BA组合诱导不定芽形成条件进行优化的结果表明,不定芽诱导培养基中仅用浓度为4 mg/L 6-BA的平均不定芽数达到3.56,显著优于与其它生长调节物质组合的处理.     

根癌农杆菌介导的苜蓿遗传转化体系的建立

苜蓿基因型是限制遗传转化的关键因素之一。从13份苜蓿材料中筛选出一份具有高频再生潜力的基因型一公农1号,并以该品种为受体转化Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因,优化了遗传转化条件,建立了农杆菌介导的苜蓿遗传转化系统,获得了大量的转基因植株,分子检测证实目的基因已经整合到苜蓿基因组中。     

一种新的蒺藜苜蓿遗传杂交方法

遗传杂交技术是开展遗传研究的基本工具,也是研究基因功能的必要手段之一。虽然对豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的研究愈来愈多,但其遗传杂交技术因难度较高而只被研究蒺藜苜蓿比较悠久的科研团体掌握。为了便于更多实验室能够掌握该项技术,本文在已报道的蒺藜苜蓿杂交方法的基础上提出了一种新的杂交技术。研究内容包括蒺藜苜蓿的花果发育周期、花解剖结构、不同发育时期花的花药发育、遗传杂交程序、母本花的选择标准以及杂交鉴定等。本研究所提出的蒺藜苜蓿杂交方法与已有其它杂交方法相比,具有操作难度低、杂交后无需特殊护理措施、杂交成功率高等特点。     

DREB2A基因对苜蓿遗传转化的研究

以黑龙江紫花苜蓿Medicago sativa主栽品种:肇东苜蓿、敖汉苜蓿、公农1号和公农2号为受体材料,系统地探讨了除菌剂种类和浓度以及卡那霉素筛选浓度等,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系;分别构建了由诱导型启动子rd29A和组成型启动子E12调控的DREB2A基因的2个植物表达载体pB2A29A和pB2AE12;采用农杆菌介导法进行遗传转化,获得大量转基因抗性植株并进行了分子生物学(PCR和Southern blot)检测.结果表明,DREB2A基因已整合到苜蓿基因组中.     

苜蓿高效再生体系研究进展

作为牧草生物技术的一个重要组成部分,苜蓿Medicago sativa组织培养工作在国内外得到了大量开展.从苜蓿组织培养中外植体和培养基的选择、细胞生长调节物质的应用以及基因型的选择4个方面阐述了苜蓿高效再生体系研究现状,并对目前研究中存在的问题进行了归纳,提出了苜蓿再生体系研究的发展趋势.     

苜蓿组织培养研究进展

苜蓿Medicago spp.组织培养已在多个种上取得成功,且以紫花苜蓿M. sativa最多。对苜蓿组织培养的外植体选择、培养基组成成分、愈伤组织和体细胞胚的诱导、植株再生以及基因型的选择5个方面阐述了苜蓿组织培养的研究现状。并进一步对目前存在的问题和发展趋势进行了归纳,以期为苜蓿基因工程和细胞工程研究提供有益的借鉴。     

蒺藜苜蓿、天蓝苜蓿、金花菜基因组SNP穿梭标记开发

蒺藜苜蓿是继拟南芥和水稻之后又一个进行全基因组测序的植物,利用蒺藜苜蓿的基因组序列,开发出可以在其他豆科植物上应用的分子标记,即穿梭标记,已成为缺乏基因组信息或基因组复杂的豆科植物基因组学及分子遗传学研究的有效手段。天蓝苜蓿和金花菜是我国最重要的两种一年生苜蓿,由于缺乏有效的分子标记,这两种苜蓿在基因组水平上的研究很少。SLAF-seq是近年来开发出的一种简化基因组测序技术,具有高通量、准确性、成本低、周期短的优点,已在众多物种的全基因组SNP标记开发上得到应用。本研究通过SLAF-seq技术对12份蒺藜苜蓿、天蓝苜蓿和金花菜材料进行简化基因组测序,共得到28.04×10⁶个读长的测序数据,276432个高质量的SLAF标签,其中58748个SLAF标签为多态性标签,平均测序深度为17.44。在58748个多态性SLAF标签中,共检测出次要基因型频率(MAF)大于0.05的SNP标记189133个。本研究开发出的SNP标记可用于一年生苜蓿的遗传多样性、遗传图谱构建和重要农艺性状的QTL定位等的研究,其种间穿梭的特性可为苜蓿属种间基因组排列顺序、系统进化关系、比较图谱构建等方面的研究提供帮助。     

蒺藜苜蓿SSR反应体系优化及在一年生苜蓿种质鉴定中的应用

利用正交设计和完全随机试验优化蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn)SSR标记的PCR反应体系。结果表明,适合于一年生苜蓿(Medicago L.)遗传分析的SSR技术体系为:10μL反应体系中TaqDNA聚合酶为1U,dNTP浓度为0.20mmol/L,Mg²⁺浓度为2.0mmol/L,引物浓度为1.5umol/L,模板DNA用量为20ng/uL;利用该反应体系将2个蒺藜苜蓿亲本和杂交种有效鉴别;利用SSR标记对19个一年生苜蓿种质进行SSR-PCR扩增,用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同种质间DNA谱带多态性丰富,通过UPGMA方法聚类分析可以明确区分19个一年生苜蓿种质。     

蒺藜苜蓿MtNSN1的克隆与功能分析

核干因子(NS)是一类广泛存在于动物细胞核中的GTP结合蛋白,主要参与胚的形成和细胞增殖,对维持细胞周期具有重要作用。本研究旨在初探蒺藜苜蓿MtNSN1的表达模式及其对生长发育的调控功能。克隆获得蒺藜苜蓿MtNSN1基因cDNA全长2193bp,其中开放阅读框为1800bp,编码599个氨基酸,蛋白分子量133.7kDa。进化树分析显示MtNSN1与大豆NSN1的氨基酸同源性为66.67%。组织器官表达分析表明,MtNSN1在蒺藜苜蓿花中表达量最高,根次之,叶中表达量最低。RNA原位杂交的结果显示该基因主要在蒺藜苜蓿生长发育活跃的茎尖分生组织及其周围的幼嫩叶中表达。MtNSN1转化野生型拟南芥得到超表达植株,通过统计分析表明超表达植株的主根长度和叶片数量都明显优于野生型。在超表达植株中5个细胞周期标记基因的表达水平均比野生型拟南芥显著上调;利用DNA化学诱变剂博来霉素对植株进行处理,发现超表达植株的根系受抑制程度小于野生型。以上结果表明,MtNSN1与蒺藜苜蓿茎尖分生组织的维持及地上、地下器官的发育有关,同时异源表达MtNSN1在转录水平上影响拟南芥细胞周期的表达。     

蒺藜苜蓿叶绿体密码子偏好性分析

本文对蒺藜苜蓿叶绿体基因组全序列密码子进行分析,筛选出50条CDS(coding DNA sequence)利用CodonW软件进行分析其密码子使用模式。结果显示,蒺藜苜蓿叶绿体基因组密码子第3位碱基GC含量为26.9%,即第3位密码子富含A和U,ENC值在37.11~51.91之间密码子偏好性较弱。相对同义密码子使用度分析显示RSCU值大于1的密码子有23个,其中以A和U为结尾20个。中性绘图分析显示GC₁₂与GC₃的相关系数为0.341,相关性不显著,回归系数为0.4843;单基因ENC比值多分布在-0.05~0.05,即大部分基因ENC值离ENC期望值较近;对应性分析,第一轴显示了12.50%的差异为主要影响因素,第一轴与ENC和GC₃的相关系数分别为0.091和-0.092,均相关不显著。综合这几项分析发现蒺藜苜蓿叶绿体基因组密码子偏好性主要受到突变的影响,但是并不是唯一的影响因素,其他因素对密码子偏好性也可能有一定的影响。最终通过高表达优越密码子方法确定得出UUA、UUG、CCU等23个密码子为最优密码子,为之后对外源基因进行改造,提高其在叶绿体中的表达效率奠定了基础。     

豆科模式植物蒺藜苜蓿基因组研究进展

鉴于豆科植物的重要性和特殊性,近年来国际上发起将蒺藜苜蓿作为豆科基因组研究模式植物。由于具有基因组小、染色体数为2×8(2n=16)、生长期短、自花授粉、根瘤固氮、遗传转化效率高、与豆科主要作物亲缘关系较近等特点,蒺藜苜蓿已代替百脉根(Lotus japonicusL.)做为豆科模式植物。国际蒺藜苜蓿基因组研究计划于2001年启动,基因组全序列测定即将完成。目前已经构建了细胞遗传学图谱、物理图谱和遗传图谱,获得EST序列189714条。蒺藜苜蓿基因组长度470Mbp(1C=0.47pg,2C=1.15pg),基因密度7Kbp/基因,平均GC含量33.3%。细胞遗传学分析表明,蒺藜苜蓿染色体基因组分成常染色质和异染色质两个明显的区域,常染色质区富集基因,异染色质区富集大量重复序列。蒺藜苜蓿80%的基因组以异染色质的形式聚集在着丝粒附近。蒺藜苜蓿与苜蓿和豌豆有非常高的共线性关系,与大豆在宏线性水平和微线性水平也有较高的共线性关系,是豆科作物比较基因组研究的好材料,有待在我国开展相关的研究。     

蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因组分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一类在种子胚胎发育后期特异表达并受发育阶段及脱水信号调节的脱水保护蛋白,在响应植物干旱、低温、高盐等逆境胁迫中具有重要功能。本研究利用生物信息学手段,在全基因组水平对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)LEA基因家族进行分析,并对其进化、基因结构、进化压力、染色体定位及基因表达模式进行了系统分析。本研究共筛选出23个蒺藜苜蓿LEA家族基因,可分为8个亚家族。基因定位结果表明,23个蒺藜苜蓿LEA基因分布于除6号染色体外的其他7条染色体上,但分布不均匀;家族成员外显子数目都不超过两个,结构简单。不同组织表达谱分析结果显示,LEA家族基因具有不同的组织表达模式,并受干旱逆境胁迫调控。本研究结果可为蒺藜苜蓿LEA基因家族的功能分析奠定基础。     

苜蓿遗传连锁图谱构建研究进展

高密度分子标记的连锁遗传图谱对分析植物遗传变异、目标性状的标记、数量性状的定位和分子标记辅助育种均具有重要价值.由于大多数苜蓿的多倍性和高度异质特点,苜蓿遗传连锁图谱的构建相对复杂,目前,已经产生了一定数量的苜蓿遗传连锁图谱.本文简要综述了苜蓿遗传图谱研究现状和常用策略,提出了构建高质量苜蓿遗传图谱的建议.     

豆科模式植物——蒺藜苜蓿

由于蒺藜苜蓿具有高的遗传转化效率、生长期短、染色体组为2×8、基因组小、自花授粉、固氮等特点,使它成为豆科生物学和基因组学研究的模式植物。本研究描述了蒺藜苜蓿的形态特征,介绍了苜蓿属植物的系统关系及蒺藜苜蓿的分类学地位,概述了蒺藜苜蓿遗传图谱构建和基因组学研究的进展。     

农杆菌介导白三叶草高效遗传转化和转基因植株再生

利用子叶下胚轴为外植体,通过农杆菌Ti质粒介导途径,建立了白三叶草高效遗传转化及转基因植株高频率再生体系。PCR检测及Southern印迹鉴定结果表明,外源T-DNA片段已整合到转基因植株的基因组中,且多以1~2个少数拷贝存在。Northern印迹结果和对报告基因GusA编码蛋白的活性检测结果表明,目的基因在部分转基因植株中高水平表达。适宜条件下外植体遗传转化后的植株再生比例达58.23%~62.12%。与对照相比,转基因植株在外部形态上没有发生改变。     

蒺藜苜蓿EST-SSRs分布特征及标记的开发

利用蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)EST数据库开发新的EST-SSRs标记.分析EST-SSRs的分布特征.利用SSRIT软件对NCBI上公布的285 285条蒺藜苜蓿EST序列进行SSR序列的检测.共检测出6688个SSR序列.分布于6512个EST中.占整个EST数据库的2.28%.其中二核苷酸...     

口蹄疫病毒抗原决定簇融合基因转化苜蓿

摘要：通过农杆菌的介导,以携带O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21 O14 A21 HBcAg的植物表达载体转化苜蓿(Medicago sativa)愈伤组织,并再生得到抗性植株。试验建立了苜蓿甘农1号愈伤组织再生系统;优化了农杆菌介导的苜蓿遗传转化系统;获得抗性再生植株4棵;GUS报告基因在转化的愈伤组织中得到瞬时表达;抗性植株PCR检测结果证实目的基因已经成功整合到苜蓿基因组中。