枯草芽孢杆菌葡萄糖酸操纵子突变株的构建

葡萄糖激酶为核黄素的生物合成原料GTP和5-磷酸核酮糖合成的关键酶,为了提高葡萄糖激酶的表达,构建了整合表达载体pRKS - 14,通过同源重组的方法将线性化的pRKS - 14转化枯草芽孢杆菌GJ05,得到GJ06,在葡萄糖酸操纵子基因gntR和gntK基因之间引入了强启动子PB14,为进一步提高核黄素的产量提供原料保障.     

枯草芽孢杆菌生物素操纵元的初步改造

为了克服生物素生物合成中的抑制作用,提高生物素操纵元基因本底水平的表达,分别构建了整合表达载体pGJj01和pGJj02,通过双交叉整合的方式先后将线性化的pGJj01和pGJj02整合到枯草芽孢杆菌AS1094的染色体上,构建了枯草芽孢杆菌GJZ01,用强启动子P43-1替换掉生物素操纵元自身的启动子Pbiotin,并在bioB和bioI基因间加入强终止子和强启动子P43-2。经PCR和Southern检测表明,整合构建正确。试验可为下一步研究生物素操纵元基因表达提供良好的宿主菌素材。     

枯草芽孢杆菌GMP还原酶基因（guaC）突变株的构建

以受体菌的guaC基因为同源重组的指导序列,构建了整合表达载体pGT9GH,通过双交叉同源重组的方法将线性化的pGT9GH整合到受体菌的染色体上,构建了guaC基因的缺失突变株B.subtilis GJ07,并在guaC基因的5′端和3′端之间引入了一个拷贝核黄素操纵子,通过PCR方法验证了同源重组的正确性,最后测定了同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量。结果表明：同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量明显高于初始菌株GJ06,发酵60 h提高了24.5%。     

枯草芽孢杆菌GMP还原酶基因（guaC）突变株的构建

以受体菌的guaC基因为同源重组的指导序列,构建了整合表达载体pGT9GH,通过双交叉同源重组的方法将线性化的pGT9GH整合到受体菌的染色体上,构建了guaC基因的缺失突变株B.subtilisGJ07,并在guaC基因的5′端和3′端之间引入了1个拷贝核黄素操纵子,通过PCR方法验证了同源重组的正确性,最后测定了同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量。结果表明：同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量明显高于初始菌株GJ06,发酵60h提高了24.5%。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

枯草芽孢杆菌作为外源基因表达系统的研究进展

枯草芽孢杆菌是目前研究较为详尽的外源基因表达宿主,但由于受自身分泌蛋白酶多、构建的表达质粒不太稳定等因素影响,其应用受到一定的限制.文章综述了枯草芽孢杆菌基因组的特征、蛋白的分泌机制、重组表达质粒不稳定的原因,指出了枯草芽孢杆菌作为外源蛋白表达系统的瓶颈及今后的研究重点.     

枯草芽孢杆菌apr基因表达载体的构建

利用PCR技术和基因重组技术构建了枯草芽孢杆菌蛋白酶基因—apr的重组表达质粒PET-22b/apr,并将其转入大肠杆菌(E.coli)BL21中,经蓝白斑筛选获得apr的表达载体。PCR后经琼脂糖凝胶电泳结果显示,在约1.5kb位置有特异性条带,与预期的枯草芽孢杆菌蛋白酶基因大小一致。重组质粒pGM-T/apr经双酶切后获得约1509bp的apr基因片段,同预期结果相一致,测序结果同GeneBank中的序列同源性达到100%。未发生任何突变。表明重组质粒pET-22b/apr构建成功。     

产β-半乳糖苷酶芽孢杆菌的筛选及产酶条件的优化

[目的]筛选产β-半乳糖苷酶的芽孢杆菌并对其产酶条件进行优化。[方法]从土壤中筛选出一株具有β-半乳糖苷酶活性的菌株,对其进行鉴定并对其发酵产酶条件进行优化。[结果]该菌株被初步鉴定为巨大芽孢杆菌。该菌株的最佳碳源是乳糖,最佳氮源是牛肉膏和蛋白胨,Na+对产酶有明显的促进作用。当乳糖含量为1.20%,牛肉膏含量为0.63%,蛋白胨含量为1.04%时,该菌株所产β-半乳糖苷酶酶活可达3.68 U/ml。初始pH值为8.0,培养温度为45℃,接种量为2%,振荡培养17 h,该菌株所产β-半乳糖苷酶的酶活最高,为5.49 U/ml。[结论]该菌株在高温条件下生长旺盛,适宜生长pH值范围广,在生产实践中具有一定的应用价值。     

热纤维素梭菌内切葡聚糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌的表达

对热纤维素梭菌Clostridium thermocellum内切葡聚糖苷酶基因CelG及其信号肽序列进行了克隆及表达研究.以热纤维素梭菌总DNA为模板,经PCR扩增获得目的,并连接到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pSW1载体,获得质粒pSW1-CelG;用感受态转化法将获得质粒pSW1-CelG转化到枯草芽孢杆菌BGSC中进行分泌表达,获得了大小约56KD的蛋白片段,且具有生物活性,证明CelG基因克隆成功并正确表达.     

枯草芽孢杆菌Z-2重组甘露聚糖酶分泌条件优化及酶学性质的研究

以pET22b(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌,对培养基、诱导温度、IPTG浓度、诱导时菌体浓度、诱导时间等参数进行优化,以提高甘露聚糖酶的产量.结果表明:当采用TB培养基、37℃下D600nm为0.6～0.7时加入IPTG(终浓度0.01 mmol·L-1),诱导8 h后发酵液中酶的活力最高.酶件质研究表明,霞组甘露聚糖酶与野生菌产生的酶性质相似,当温度为55～60℃、pH为7.5时活力最高,低于55℃、pH 6.5～7.5时酶性质稳定,供试的大部分金属离子对酶活力影响较小,只有DTT有明显的促进作用.     

枯草芽孢杆菌bioI基因的克隆和高效表达及BioI蛋白的纯化

【目的】克隆和表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bioI基因并纯化表达产物。【方法】提取B.sub-tilis1A747基因组DNA,从中扩增bioI基因并将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的表达载体pET-28a(+)上,构建bioI的表达载体pET28a-bioI。将重组质粒pET28a-bioI电转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,对表达产物BioI用Ni2+-NAT亲和层析树脂进行纯化,并对纯化蛋白进行波长扫描。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bioI,酶切鉴定结果正确并在大肠杆菌中表达成功,经IPTG诱导8 h后,重组蛋白BioI的表达量占总可溶性蛋白的20%;波长扫描发现,重组蛋白BioI在400 nm处有特征吸收峰。【结论】bioI基因克隆表达成功,其表达产物BioI具有P450蛋白的特征,为蛋白性质的进一步研究和抗体的制备奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌对百合枯萎病的防治效果

采用菌丝生长速率法及孢子萌发法,研究枯草芽孢杆菌对百合枯萎病菌的抑杀效应。枯草芽孢杆菌无菌滤液在一定体积分数范围内能有效抑制枯萎病菌菌丝生长,减少孢子萌发,且随着无菌滤液体积分数的增加,孢子萌发抑制率也增大。体积分数为20%的枯草芽孢杆菌无菌滤液,处理后7d抑制率可达78.8%。体积分数为60%时,可完全抑制孢子萌发。盆栽防治试验表明,枯草芽孢杆菌菌液对百合枯萎病的发病抑制率达65.3%。且该菌液对百合的生长有一定的促生功效,说明枯草芽孢杆菌对百合枯萎病有抑菌和防病作用,且抑菌作用随枯草芽孢杆菌菌液体积分数的增加而增强。     

一株枯草芽孢杆菌环状糊精葡糖基转移酶的提取、纯化和性质

枯草芽孢杆菌SC3-2是一株高产环状糊精葡糖基转移酶(CGTase)的菌株,将其发酵液通过(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-纤维素(DEAE-cellulose-52)离子交换层析和Sephadex S-200凝胶层析进行纯化。经过几步纯化后CGTase比活力达到4 923 U/mg,纯化倍数达11.37倍,回收率为20%。通过对酶性质的测定,结果表明:在pH6.5,30℃条件下,菌种产酶量最高;在pH5.5~7.5,40℃以内该酶较为稳定;Mn2+和Ca2+对酶活具有一定的促进作用;EDTA、Na+、Fe3+、Cr3+、Zn2+、Cu2+对酶活影响不大;SDS、Ag+和Hg+使酶几乎失去活性。本研究为环状糊精葡糖基转移酶的应用提供了依据。     

应激诱导木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中表达

克隆含有信号肽碱性木聚糖酶基因(xynA)片段与依赖转录起始因子σB的启动子PgsiB片段,将其克隆至实验室前期构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体上,并转化入枯草芽孢杆菌WB700菌株,获得重组菌BXS-W.当细菌生长至对数期中期时,施加不同的应激处理,采用DNS法测定木聚糖酶活性.结果显示,获得了xynA与PgsiB片段;成功构建表达载体pBXS,并获得重组菌株BXS-W;应激试验表明,施加的5种应激条件均极显著提高(P＜0.01)木聚糖酶基因的表达量,其中以乙醇应激效果最好.     

用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌EDR4突变体库

为筛选枯草芽孢杆菌EDR4拮抗相关基因,利用转座子TnYLB-1构建该菌株的插入突变体库。通过对种子液OD600值、转接培养液Ⅰ继续培养OD600值及转接培养液Ⅱ后的孵育时间3因素设计正交试验,转化过程中加入pMarA质粒的不同量及质粒与感受态细胞共培养的不同时间研究2因素对转化效率的影响,确定pMarA对EDR4的转化体系。通过50℃高温诱导培养产生EDR4的插入突变体,挑取单菌落2 756个,构建EDR4的插入突变体库,随机挑选14株突变体经PCR检测转座子TnYLB-1序列,发现转座子已成功插入到EDR4基因组中;进一步通过Southern杂交验证,发现转座子TnYLB-1主要以单拷贝形式随机插入,也有部分多拷贝插入。此突变体库的建立可为以后筛选该菌株拮抗相关基因等研究奠定基础。     

磁化水对根瘤菌和生防枯草杆菌的生物效应

以苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)XGL026和生防枯草杆菌(Bacillus subtilis)2-4菌株为材料,研究4 000Gs和20 000Gs的磁处理水对其生长和功能的影响。结果表明,4 000Gs磁场强度下处理的磁化水对苜蓿根瘤菌生长繁殖有明显促进作用,菌体繁殖速度加快,培养液浓度增加,活菌数显著提高。4 000Gs磁化1次(T1)、2次(T2)和3次(T3)处理活菌数最大值分别较对照(普通水)增加11.02%、76.92%、72.47%,T2、T3处理缩短了达到最高活菌数的时间。苜蓿盆栽试验表明磁化水处理的单株结瘤数较对照平均增加5~11个;接种T3磁化水培养的根瘤菌+T3磁化水浇灌处理,苜蓿结瘤数的增加幅度最显著(P0.01)。试验发现,4 000Gs磁化1次(T1)、2次(T2)的磁处理水对枯草杆菌前期生长速度有一定延缓,但对生长量影响不大。4 000Gs磁化3次(T3)和20 000Gs磁化1次(T4)的磁处理水对枯草杆菌的整个生长期都有显著的抑制作用,活菌数较对照降低33.17%和93.52%(P0.01)。平板对峙试验测定磁处理水培养的枯草杆菌对棉花黄萎病菌的抑菌效果显示,与对照相比,T1磁处理水对枯草芽孢杆菌的抑菌能力有一定增效作用,而T3和T4磁处理水培养的枯草杆菌对棉花黄萎菌的抑菌效果显著减弱(P0.01)。     

枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌肽的提取及其应用

为了提取枯草芽孢杆菌抗菌肽以探索其对食品的防腐效果,选用枯草芽孢杆菌DZSY21、解淀粉芽孢杆菌FZB42和枯草芽孢杆菌OKB105 菌种发酵,然后将这3个菌种的发酵上清液分别与丙酮按1:2的体积比混合,旋转蒸发浓缩得到3种菌的抗菌肽粗提物。对抗菌肽的热稳定性试验可知3种菌的抗菌肽经100 ℃加热30 min后抑菌效果均有小幅度降低,但抑菌活性仍较强。抗菌肽蛋白酶稳定性试验结果显示,3种菌的抗菌肽对胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都很敏感;应用性试验中采用牛奶、苹果、肉等作为食品模型,结果显示经枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌肽处理后的试验组品相均明显好于对照组。表明枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌肽具有较好的防腐效果。     

2株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及特性研究

【目的】寻求适合制作水产类微生态制剂的益生菌。【方法】从养鱼塘底泥和健康鲫鱼Carassius auratus肠道中分离芽孢杆菌,结合细菌形态学、生理生化特征和16S rRNA序列分析对其进行鉴定,对菌株安全性、高温耐受性、酸性耐受性、拮抗性及产酶情况等特性进行研究。【结果】分离到2株芽孢杆菌,分别命名为B1和B2,细菌形态学、生理生化特征和16S rRNA序列分析的结果显示,B1和B2均为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。特性研究结果证实B1、B2菌株都具有较好的安全性、高温耐受性和酸性耐受性,可对致病性大肠埃希菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila以及温和气单胞菌A.sobria有良好的体外抑菌能力,均具有产脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力。【结论】分离到2株性能优良的枯草芽孢杆菌,可将其作为水产微生态制剂的候选菌株。     

枯草芽孢杆菌DNKAS对分枝列当的防效、安全性及作用机理

分枝列当是全寄生性恶性杂草,为探讨生防菌对分枝列当寄生和生长的影响,以枯草芽孢杆菌 DNKAS为材料,通过盆栽、大田和酶活试验,研究DNKAS对分枝列当的防治效果、寄生体系植株生长量、常见作物果蔬生长安全性评价及对寄生体系防御酶系的影响。结果表明：在温室及田间验证下,枯草芽孢杆菌DNKAS对分枝列当防治效果分别为49.7%与43.1%;同时,在大田试验中,枯草芽孢杆菌DNKAS使产量和单果质量分别提高45.91%和45.89%,病虫果数减少48.5%。对5种常规作物生长安全性检测结果表明,该菌剂未对植物生长产生畸变,且具备一定促生作用;通过检测寄生体系的防御酶活性,施用枯草芽孢杆菌DNKAS使加工番茄根部苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶活性分别增加 7.72%、111.41%、24.24%、14.06%,分枝列当酶活分别提高44.32%、137.59%,53.53%、15.67%。可见,枯草芽孢杆菌在分枝列当防除中作用是有效的,在分枝列当寄生期可提高寄生体系防御酶系统活性,阻碍分枝列当的寄生规模和数量,减轻其对寄主植物的危害;同时,菌剂的施用对常见果蔬等生长指标未见不良作用。     

麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

考察麦芽糖诱导木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌WB700中的表达。以麦芽糖为诱导剂,对诱导质量分数、诱导时机、诱导温度和麦芽糖的添加方式等主要因素进行了分析比较。结果表明,当菌体生长至发酵液吸光值OD600达到1.3时加入终质量分数为4.5%麦芽糖,37℃,持续诱导10 h,木聚糖酶活力达到最高,为56.32 U。通过SDS-PAGE检测对比显示:经麦芽糖诱导表达的木聚糖酶比不加麦芽糖诱导的木聚糖酶表达量高,表达效果更明显。