大鲵虹彩病毒的PCR检测及初步应用

通过了解大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)在EPC细胞接毒情况和PCR的实际检测情况,为大鲵的病毒检测提供必要判断依据和检测方法.通过细胞接毒和组织分离分别提取病毒质粒,进行普通PCR扩增,电泳分析,比较病毒细胞培养和组织直接提取结果.Gsiv病毒体外培养:经传代48 h的EPC细胞,25℃培养,12h后可观察到CPE出现,24 h病变明显,CPE达15％,48 h后CPE可达70％,72 h后细胞完全脱落;PCR检测:对3个样本分别从组织提取和经细胞扩增分离的病毒进行普通PCR扩增检测,经细胞培养扩增的3个样本全部呈阳性;经组织提取的3个样本,2个呈阳性,一个呈阴性;电泳观察,病毒的扩增产物在500 bp左右.在体外环境下GSIV是高病力的一种病毒,对EPC细胞在25℃时效应时间为3d,普通PCR经组织的检出率低,经细胞培养扩增可提高检出率但耗时久,不利于实际生产中快速、准确诊断疫情的需要.     

蛙虹彩病毒巢式 PCR检测方法的建立

蛙虹彩病毒属(Ranavirus)病毒宿主广泛,可以感染爬行类、鱼类和两栖类,大部分病毒对宿主都有较强的致病性和致死性.为建立一种快速高效的蛙虹彩病毒的检测方法,本研究利用中华鳖虹彩病毒(soft-shelled Turtle Iridovirus,STIV)核衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因保守区设计内引物和外引物,建立了特异性检测流行性造血器官坏死病毒(Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus,EHNV)、中华鳖虹彩病毒和虎纹蛙虹彩病毒(Tiger Frog Virus,TFV)的巢式PCR(巢式PCR)检测方法,并制备了重组质粒pGem-T-S作为阳性对照标准品.检测限试验结果显示,该方法可以检测102拷贝的病毒粒子.而且与传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒、病毒性出血性败血症病毒、斑点叉尾(鱼回)病毒、传染性胰脏坏死病毒、真鲷虹彩病毒、牙鲆弹状病毒以及锦鲤疱疹病毒等其他非蛙虹彩病毒无交叉反应.该体系具有简便、快速、敏感、特异性高、低成本等特点,为诊断与预防蛙虹彩病毒提供了一项重要的技术手段.     

真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用

以真鲷虹彩病毒(Red-sea bream iridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Primer Express 3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR Green I实时定量PCR检测方法.将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.184 1gX+40.270,相关系数R2=0.996 9.熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃.该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性.利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析.     

中国大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)PCR检测方法的建立及其应用

大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是中国工厂化养殖大菱鲆的主要病毒性病原之一.本研究提取了该病毒DNA,依据其主要衣壳蛋白基因序列设计了PCR引物,优化了PCR反应参数,建立了TRBIV的PCR检测方法,测试了该方法的特异性和灵敏度,并应用该方法开展了TRBIV的流行情况调查及研究了大菱鲆的外观症状(红体)与TRBIV感染的关系.结果显示,本研究建立的TRBIV PCR检测方法可以从相当于100ng病鱼组织中或103数量级的病毒粒子中检出TRBIV,也可以在不杀死被测鱼的情况下,仅从鱼体中抽取少量血液即可在1天的时间内完成大量样品的TRBIV检测,但不能从健康大菱鲆脾组织和患淋巴囊肿牙鲆的囊肿组织中扩增出任何产物,说明该方法具有很高的灵敏性和特异性;在所调查的山东半岛5家大菱鲆养殖场的19尾大菱鲆中,7尾为TRBIV阳性或弱阳性;具有"红体"症状的大菱鲆应当划分为"病毒性红体病"、"细菌性红体病"和"非病原性红体症"3种不同的类型.本研究为TRBIV的流行情况和传播途径调查、疾病的快速诊断和控制提供了技术手段;调查结果显示TRBIV已遍布山东半岛沿海地区的大菱鲆主产区,在地域上相距较远的多个大菱鲆养殖场流行,今后需要密切关注该病毒的传播和流行.     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

多重PCR在创伤弧菌快速检测中的应用

建立多重PCR方法检测水体及海产品中的创伤弧菌。针对创伤弧菌的gyrB基因的不同位点设计了3对引物,扩增片断的大小分别为481、702、1065bp。该方法的灵敏度为10^2cfu／ml。共对3种海产品进行了创伤弧菌的检测,结果在3种海产品中均能特异性地检测到创伤弧菌。该方法快速,灵敏度高,特异性强。为海产品及水体中的创伤弧菌的检测提供了有效的方法。     

巢式PCR检测鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)

鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)是鳜暴发性传染病的主要病原,给鳜养殖业造成了严重的经济损失,因此快速、灵敏的检测方法对鳜养殖业的发展具有非常重要的意义.根据鳜ISKNV主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计了2对引物,利用巢式PCR方法对病鱼脾肾组织进行扩增,建立了ISKNV快速特异的巢式PCR检测方法.应用该方法对含MCP基因的质粒进行倍比稀释后检测扩增的灵敏度可达到5 fg;巢式PCR检测的灵敏度是一步法PCR的104倍以上.     

PCR法在鸡毒支原体污染检测中的应用

[目的]利用PCR技术,探究鸡毒支原体(MG)的检测方法。[方法]针对MG脂蛋白的基因序列,建立PCR扩增体系,测定其灵敏度和特异性,并对鸡胚样品进行检测。[结果]PCR扩增得到了400bp的基因片段,最低检出浓度为0.2 pg·μL~(-1);该PCR法仅与MG的DNA反应,与大肠杆菌、猪肺炎支原体、新城疫病毒、沙门氏菌的DNA或cDNA反应结果均为阴性;利用该PCR对鸡胚样品进行检测,核酸阳性率为76%。[结论]该研究初步建立了基于MG脂蛋白基因的特异性PCR检测方法,为MG的临床检测奠定了基础。     

基于荧光定量PCR的鳜传染性脾肾坏死病毒滴度检测方法

针对传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的ORF007基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立了ISKNV的实时荧光定量PCR方法。采用CPE法对连续10倍稀释的ISKNV培养液的滴度进行了测定,同时采用荧光定量PCR法测定病毒拷贝数。结果显示,荧光定量PCR测定的病毒拷贝数与CPE法测定的病毒滴度具有良好的线性关系,其线性方程为y=1.076x+0.545(R2=0.998 6),其中y为基因组拷贝数浓度的对数,x为病毒滴度TCID50的对数。研究表明,荧光定量PCR法可替代CPE法应用于ISKNV疫苗抗原的定量,大大缩短了疫苗制备的时间,为疫苗生产提供了方便。     

种属特异性PCR技术在检测鹅肥肝掺假中的应用研究

建立起一种用于检测鹅肥肝是否掺假的方法:种属特异性PCR技术。以鹅、鸭的12SrRNA基因序列设计特异引物,扩增目的片段分别为97bp和196bp。以三类温度处理和0.1%～100%的鸭肥肝掺假比例,分析方法的有效性和灵敏性。结果表明,这种方法的效果是不受样品被长时间加热的影响(高至100℃,10min);同时,即使当掺假比例只有0.1%时,仍能有效扩增出2特异条带。说明本方法适用于快速、准确地检测鹅肥肝掺假的需要。     

PCR技术在水产养殖动物细菌性病原检测中的应用

近年来PCR技术的迅速发展，带动了水产病原的检测技术不断向着快速、准确的方向发展。文章回顾了PCR技术在水产养殖动物细菌性病原检测中应用，并对水产养殖细菌性疾病诊断技术的发展方向作了展望。     

酸性α-醋酸萘酯酶染色法在鳜细胞免疫水平检测中的应用研究

研究了酸性α-醋酸萘酯酶染色法在鳜细胞免疫水平检测中应用的可行性。用不同比重的淋巴细胞分离液对鳜外周血中的淋巴细胞进行分离,结果表明比重为1.080的分离液可最大程度地将鳜外周血中的淋巴细胞分离出来。用酸性α-醋酸萘酯酶染色法对分离出的淋巴细胞进行染色,结果显示最佳的染色条件为在pH6.0~6.5的孵育液中37℃孵育90 m in,然后2%甲基绿37℃复染10 m in,酸性α-醋酸萘酯酶阳性细胞胞核被染成绿色而胞浆被染成红色,阴性细胞胞核和胞浆都被绿染。对正常未免疫鳜与嗜水气单胞菌脂多糖和鳜病毒主要衣壳蛋白免疫一周后的鳜外周血淋巴细胞染色计数,结果酸性α-醋酸萘酯酶阳性细胞所占的比例分别为15%~18%、33%~40%和26%~29%,方差分析表明免疫组与对照组阳性率差异极显著,说明α-醋酸萘酯酶染色法可用于鳜细胞免疫水平的检测。     

HACCP在柘林湖斑鳜网箱养殖中的应用

在水产养殖方面应用HACCP体系,就是要在亲体-幼苗-养成-销售整个过程中对包括养殖场在内的周围环境、养殖水质、苗种、饲料、水产药物等方面进行全方位的监控,针对各个重要的环节进行危害分析,并加以控制,确保养殖产品不会对人类的健康造成危害。以柘林湖斑鳜网箱养殖过程为例,对HACCP在柘林湖斑鳜网箱养殖中的应用进行了分析和研究。     

PCR技术在对虾养殖中的应用

生物PCR技术又称聚合酶链反应,是一种体外核酸扩增系统,通过反复循环反应,使模版DNA得以扩增,用于放大特定的DNA片段,可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术是近10年来发展最快、应用最广的分子生物学技术,与传统诊断方法相比,它具有敏感性及特异性高、简单、快速等特点,可应用于医学、生物及水产养殖病毒检测等方面。     

实时荧光定量PCR技术及其在水生动物病毒病定量检测中的应用

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因的方法,其最早的应用报道是Saiki等[1]1985年应用于β-珠蛋白基因的扩增和镰状细胞性贫血的诊断分析.     

县级实验室检测技术在畜牧生产中的应用分析

县级实验室技术是诊断和检测县级动物疫情的主要手段。阐述了县级实验室检测技术在畜牧业生产中的发展现状,并提出了相关建议,希望能够促进县级实验室检测技术的创新。     

快速检测在基层水产品质量安全生产中的应用

<正>水产养殖过程中,采用健康生态养殖模式、科学防治养殖病害和规范用药十分重要。不仅能降低养殖病害发生率、提高养殖产量和增加经济效益,更有利于保障水产品质量安全。但是,由于部分养殖户缺乏科学养殖技术,追求高产量、高效益,在实际生产过程中,忽视养殖品种结构优化和养殖水域环境保护,导致养殖病害频发^[1]。盲目用药以及不遵守休药期规定,出现水产品药物残留问题,严重影响了水产品质量和消费安全。     

斑鳜池塘精养技术探索

<正>斑鳜隶属鲈形目,科,鳜亚科,鳜属,又称岩鳜,因其体圆似桶型,故有竹筒鳜之称。因其肉质细嫩、鲜美,具有极高的营养价值,故有淡水石斑之美誉,深受消费者的喜爱。斑鳜属于底层鱼类,在江河、湖泊中都能生活,主要分布在长江以南各水系,喜欢栖息于水质清新,有微流水环境中,以小鱼小虾为食。近几年来,随着国内外市场的需求量剧增,斑鳜养殖规模不断扩大,本文从池塘精养角度开展相关技术研究,旨在完善养殖技术,为提高养斑鳜殖经济效益、降低养殖成本,提供相关技术参考。     

中国大菱鲆虹彩病毒主要衣壳蛋白基因的PCR扩增及序列分析

应用同源PCR技术，从被一种球状病毒感染的患病大菱鲆（Scophthalmus maximus）脾脏和肾脏组织中扩增出了一段长度为620bp的DNA片断。序列测定和Blast分析表明，该DNA片断与鱼类虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）C末端编码区的DNA序列高度相似，由此证实感染养殖大菱鲆的这种球状病毒为一种鱼类虹彩病毒，暂命名为大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）。多序列比对和分析发现，TRBIV MCP C末端的205个氨基酸序列与GenBank中20种虹彩病毒相应序列的相似性分别为99．47％（韩国大菱鲆虹彩病毒）、97％～98％（待指定病毒属的7种病毒），以及50％以下（蛙病毒属、淋巴囊肿病毒属、虹彩病毒属的12种病毒），由此绘制出了包含TRBIV在内的21种虹彩病毒的系统发育树。研究结果表明，感染中国养殖大菱鲆的TRBIV属于虹彩病毒科待指定病毒属，位于该属ISKNV亚群和RSIV亚群之间，是该病毒属的一个新成员。     

巢式PCR技术在猪瘟病毒检测中的应用

根据猪瘟病毒的Alfort株、Brescia株和C-株(SK-6)核苷酸序列,利用primer5.0软件设计1对用于一扩引物p1a/p1aB,扩增的片段为305bp,1对用于二扩的引物p2a/p2B,扩增的片段为172bp,建立猪瘟病毒的巢式PCR检测方法。利用该方法对山东某规模化猪场中临床上疑似猪瘟病例的扁桃体、脾、肾等组织进行检测,用引物p1a/p1aB在305bp处扩增出目的条带;引物p2a/p2B在172bp处扩增出更加明显的目的条带,确诊为猪瘟病毒感染。试验结果表明该方法快速检测病料组织中的猪瘟病毒是可行的,在猪瘟的早期检测及预防、控制上起到重要作用,可用于猪瘟临床诊断。