MiR-130c-5p靶向乌鳢水泡病毒g基因抑制病毒增殖

MicroRNA(miRNA)是一类内源性的非编码RNA,参与调节病毒复制、细胞增殖或凋亡以及肿瘤发生等生物反应。本研究探讨了miR-130c-5p在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)感染中潜在靶基因g的靶向关系以及对病毒复制的影响。本研究以斑点叉尾鮰卵巢(Channel catfish ovary, CCO)为实验材料,通过qRT-PCR和Western blot测定SHVV不同感染时间和感染剂量条件下,病毒基因水平和蛋白水平以及miR-130c-5p变化情况。此外,将SHVV的g基因上miR-130c-5p对应的靶序列克隆到质粒pmirGLO,构建质粒pmirGLO-G用于双荧光素酶报告实验进行靶基因验证。结果显示,随着SHVV感染时间及剂量的不断增加,miR-130c-5p和g基因的表达水平都显著上调。进一步实验证明,miR-130c-5p类似物和pmirGLO-G质粒共转染可显著抑制荧光素酶活性强度,而转染miR-130c-5p抑制剂则明显上调了pmirGLO-G报告载体的荧光信号。此外,miR-130c-5p的过表达显著降低了病毒G基因的mRNA及蛋白表达,而抑制miR-130c-5p的表达则上调了g基因的mRNA及蛋白的表达水平。研究结果表明,miR-130c-5p通过靶向SHVV的g基因,引起G蛋白的降解,从而抑制SHVV的增殖。本研究结果为理解microRNA调控SHVV的致病机制提供了重要基础,为抗SHVV疫苗等药物的研发提供了理论支持。     

异育银鲫内参基因的筛选

内参基因在实时荧光定量PCR(qRT-PCR)中具有校准的作用,然而鲤疱疹病毒Ⅱ型感染异育银鲫内参基因目前仍未见研究报道。采用qRT-PCR技术检测不同处理条件下异育银鲫组织和尾鳍细胞GAPDH、EF-1α、18S rRNA和β-actin 4个候选内参基因在组织和尾鳍细胞的转录水平,利用软件geNorm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct分析了其表达量的稳定性,以筛选出健康异育银鲫不同组织以及鲤疱疹病毒Ⅱ型感染的肾脏、脾脏和异育银鲫尾鳍细胞在不同时间均较稳定的内参基因。geNorm稳定值以及4个内参的表达量Ct值分析显示,健康异育银鲫脑、脾脏、肾脏、肌肉、鳃、肠、肝脏和心脏组织中β-actin和EF-1α都是比较稳定的内参基因;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染肾脏和尾鳍细胞不同时间点,内参基因β-actin稳定性最佳;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染脾脏不同时间点时,EF-1α稳定性最佳。分别以4个候选内参基因为内参分析PIN1基因在肾脏组织不同感染时间的相对表达量,结果进一步证实,PIN1基因在肾脏组织感染不同时间点以β-actin为内参时,其表达量呈下降趋势,与cDNA文库测序中的表达量分析结果一致,各时间点的表达量差异极显著(P<0.01)。本试验结果有利于研究异育银鲫在不同处理条件下基因的表达分析,可为获得精准的结果奠定理论基础。     

低氧胁迫下鲢miR-17a-5p及其靶基因分析

为了探究miR-17a-5p在鲢低氧胁迫下的功能,在前期鲢small RNA测序的基础上对鲢miR-17a-5p进行靶基因预测及功能富集分析,通过双荧光素酶活性验证其与HIF-1α的靶向关系,并检测低氧胁迫下miR-17a-5p和其靶基因在鲢肝脏、脑、心脏和鳃四个组织中的动态表达特征。结果显示,鲢miR-17a-5p在不同物种间高度保守,预测出381个miR-17a-5p的潜在靶基因显著富集在硫代谢、mTOR信号通路以及萜类骨架的生物合成3个KEGG信号通路上。miR-17a-5p可与HIF-1α mRNA的3′UTR结合,并降低HIF-1α mRNA水平,低氧胁迫下miR-17a-5p的表达呈下降趋势,而HIF-1α表达则呈上升趋势;3个显著富集KEGG通路中的11个miR-17a-5p潜在靶基因在低氧胁迫过程中的不同组织中的表达,尤其是肝脏中的表达,除SGK1外,均呈显著上升趋势。研究表明,低氧胁迫下鲢各组织中miR-17a-5p的表达下调减弱了其对靶基因的抑制作用,进而导致HIF-1α、ddit4和Lrp5等响应低氧胁迫的基因表达上调。本研究为低氧胁迫下鲢miRNA的表达与调控机...     

花鲈cox6a基因与相关miRNA的鉴定及其在盐度适应中的表达调控分析

细胞色素c氧化酶（COX）是线粒体电子传递链的末端酶,COX6A是细胞色素c氧化酶的核编码亚基之一。为丰富花鲈（基因及相关miRNAs在花鲈渗透调节机制中的潜在作用,本研究开展了花鲈cox6a基因的miRNAs,并对其与）。系统进化树分析进一步确认了两个花鲈在垂体、脑、肝脏和肾脏中的表达量较高,基因的miRNA：miR-30e-5p、miR-223、miR-200a-3p和miR-155-5p,但没有发现可能靶定基因以及miR-30e-5p、miR-223、miR-200a-3p都呈现显著差异表达,而miR-155-5p仅在适应高盐环境时出现了显著的差异表达。这表明,基因和4个miRNAs在花鲈的渗透调节过程中发挥潜在作用。其中miR-30e-5p、miR-223和miR-200a-3p的表达趋势与cox6a2基因的表达调控。本研究为探讨花鲈适应不同盐度环境的渗透调节机制提供了基础数据。     

乌鳢水泡病毒P蛋白异构体的鉴定及其功能初探

为了鉴定乌鳢水泡病毒(SHVV)磷蛋白(P)的异构体并研究其在病毒增殖中的作用,本研究扩增了SHVV的P基因,构建了原核表达质粒pET32a-P,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化His-P蛋白,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用该抗体对SHVV的P蛋白异构体进行鉴定。进一步利用增强性绿色荧光蛋白(EGFP)研究了P蛋白异构体的亚细胞定位,并通过定量PCR(qRT-PCR)、Western blot及TCID_(50)研究了过表达P蛋白异构体对SHVV增殖的影响。结果显示,SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(CCO)出现3条P蛋白带,进一步验证表明,其中2条带分别是P蛋白(又称P1)及其异构体P2。亚细胞定位实验发现P1和P2主要定位在细胞质,但是可以在核质中穿梭。在CCO细胞中过表达P1、P2均能促进SHVV增殖。因此,SHVV在感染过程中能产生P蛋白(P1)及其异构体P2,且P1和P2对SHVV增殖发挥重要作用。研究结果有助于阐明SHVV的致病机理以及弹状病毒P蛋白异构体的功能。     

脊尾白虾GAPDH基因的克隆及其内参基因稳定性分析

为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD~+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。     

合浦珠母贝实时定量PCR内参基因的稳定性比较

以合浦珠母贝（Pinctada fucata）为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术检测了甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin）和18S核糖体rRNA（18S rRNA）3个管家基因在合浦珠母贝不同组织、性腺发育时期、胚胎发育时期mRNA水平的表达情况。同时比较了BestKeeper、geNorm和NormFinde软件对试验数据处理的差异,从中选出合适的内参基因。结果表明β-actin在不同组织和胚胎发育不同阶段表达最稳定,18S rRNA在性腺发育不同时期表达最稳定。     

17α, 20β 双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟相关基因表达内参基 因的筛选

本研究检测了18S rRNA(18S)、28S rRNA(28S)、组织蛋白酶Z(cathepsin Z,CTSZ)、延伸因子1-α(elongationfactor 1-α,EF-1α)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapdh)、β肌动蛋白(β-actin)6个候选内参基因在17α,2β双羟孕酮(DHP)诱导鲤(Cyprinus carpio)卵母细胞最终成熟过程的表达情况,并应用不同的内参分析软件对数据进行了分析.Bestkeeper软件分析表明EF-1α的变异系数和标准差是6个候选内参基因中最低的,且Bestkeeper指数在6个候选内参基因中最高,说明其表达稳定性最高,适合做为内参基因;geNorm软件分析认为需要同时使用EF-1α和CTSZ两个内参基因来校正目标基因的表达;NormFinder软件分析同样表明EF-1α是6个候选内参基因中表达最稳定的;最后通过RefFinder软件综合比较分析,确定EF-1α相对于其他5个候选内参基因,在17α,20β双羟孕酮诱导卵母细胞最终成熟阶段表达最为稳定,可作为内参校正17α,20β双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟阶段各基因的表达情况.     

翘嘴鳜MyomiRs时空表达特征及靶向Pax7的预测分析

MyomiRs为一类肌肉特异性microRNAs (miRNAs),对于肌细胞的增殖和分化具有重要作用。本研究旨在探究翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)4种MyomiRs基因(miR-1a、miR-133a-3p、miR-206和miR-499)的时空表达及其在短期饥饿胁迫下的表达特征,并预测分析4种MyomiRs对Pax7的调控作用。应用实时荧光定量PCR检测4种MyomiRs在翘嘴鳜不同组织、胚后不同发育阶段的白肌以及饥饿5d白肌中的表达情况，并利用RNAhybrid对4种MyomiRs与Pax7 mRNA 3′UTR的靶向位点进行预测。结果显示, miR-1a、miR-133a-3p和miR-206在D60 (出膜后60 d)高表达, miR-499在D100高表达。miR-1a和miR-133a-3p在红肌、白肌和心肌中高表达,在其他组织中表达量低。miR-206在红肌和白肌中高表达,在其他组织中表达较量低。miR-499在心肌中表达量较高,在红肌和白肌中的表达量次之,其他组织中表达量低。饥饿5d后4种MyomiRs的表达均显著上升,表明鳜骨骼肌可能对饥饿胁迫做出应激反...     

草鱼miR-462通过靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1调控嗜水气单胞菌感染诱导的免疫应答

为探究miR-462在嗜水气单胞菌感染草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kideny,CIK)后的调控机制,实验利用荧光定量技术检测了CIK细胞感染嗜水气单胞菌后miR-462表达水平的变化;运用RNAhybrid软件预测miR-462的靶基因,利用双荧光素酶报告基因系统进行确定;此外还分析了miR-462对靶基因下游基因的调控作用。结果显示,在CIK细胞感染嗜水气单胞菌的过程中,miR-462的表达发生显著变化;cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达先降低后升高,与miR-462的表达模式呈负相关。双荧光素酶报告系统显示,miR-462可靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1的3′非编码区抑制其表达,过表达miR-462可以显著抑制cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达。转染miR-462模拟物后,下游slc4a4a、tnfrsf5、cxcl9和cxcl11基因的表达受到抑制。研究表明,miR-462参与调控嗜水气单胞菌感染后草鱼CIK细胞中的免疫应答。cx32.2、slc9a3.1和tbk1被鉴定为miR-462的靶基因。miR-4...     

Emaciation of pond-cultured snakehead, Channa striatus (Fowler)

Abstract. A new disease condition which may affect up to 20% of a population has been recognized in pond cultured snakeheads, Channa striatus (Fowler). Clinically, affected fish are inappetent and severely emaciated; histologically and ultrastructurally, emaciated pond reared snakeheads display extensive striated myofibrillar and sarcoplasmic degeneration and necrosis with inflammatory changes.     

月鳢人工繁殖技术的初步研究

研究了亲鱼的饵料、催产剂的种类及剂量以及不同孵化方式对月鳢人工繁殖效果的影响。用鲜活野杂鱼和颗粒饲料为主要饵料培育亲鱼 ;用HCG、LRH -A2 、PG及其混剂和不同剂量进行催产 ;用孵化槽、微流水、静水等 3种方式孵化。结果表明 :以野杂鱼为主要饲料 ,用PG、HCG和LRH -A2 的混合剂进行人工催产 ,用微流水孵化的效果最佳 ,催产率达 10 0 % ,受精率、孵化率在 88%以上。     

池塘单养乌鳢高产技术

为了探索池塘增产增收的新途径,以提高产品质量,达到优质高产高效的目的,我们于１９９７年在沅江市南大镇新跃村进行了２１口池塘,面积５６０２８ｍ２的高密度单养乌鳢的试验。１材料与方法１１池塘条件南大镇新跃村的池塘属乡村小水面,是近年利用农家屋前屋后的...     

一株鳢科鱼源弹状病毒的分离及鉴定

为研究近来鳢科鱼类疫病频发的病因,实验对采集的患病杂交鳢病料分别从细菌学和病毒学两方面进行病原分离和鉴定。排除细菌感染的可能后,通过细胞培养技术、回归感染实验、电镜技术、分子生物学技术等进行病毒学分析,最终分离到一株弹状病毒,命名为HSHRV-C1207(Hybrid Snakehead Rhabdovirus-C1207)。实验结果显示,该病毒在EPC、FHM、GSB、SFC、CIK等 8种细胞中都能复制,并对其中6种细胞产生明显的细胞病变效应(CPE)。用分离的病毒进行回归感染实验,可使感染的杂交鳢复制出自然发病鱼的相同症状,且死亡率达90%。感染病料组织液的EPC细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量子弹状病毒聚集,直径约60 nm,长度约为160 nm,形态和排列方式与已报道的鱼类弹状病毒相似。参考OIE中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的检测引物及根据乌鳢弹状病毒(SHRV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、比目鱼弹状病毒(HIRRV)的G蛋白基因设计特异性引物,分别对自然发病病料组织、接种病料组织的细胞进行RT-PCR扩增,仅针对SCRV的引物能扩增出大小约350 bp 的片段。对HSHRV-C1207株的G基因进行序列测定和分析,结果表明其核苷酸序列同SCRV和SHRV的同源性分别为93.8% 和 20.4%,推导的氨基酸序列同源性分别是93.7%和18.3%。用G基因推导氨基酸序列与其它弹状病毒的G蛋白进行系统进化树分析,表明该毒株与水泡性病毒属聚为一支,其中与SCRV的亲缘关系最近,而与属于诺拉弹状病毒属的SHRV相距甚远,可能为SCRV的变异株或一个新的毒株。     

Weaning methods using formulated feeds for snakehead (Channa striata and Channa micropeltes) larvae

The culture of snakehead fish (Channa striata and Channa micropeltes) in Vietnam is limited, and snakehead culture has been banned in Cambodia, because traditional practices include capture of fingerlings from the wild as seed, as well as capture of small‐size (also known as trash fish or low‐value) fish. As hatchery breeding technology has improved, we investigated the optimal weaning practices for these two species. Both laboratory experiments and farm trials were conducted. For C. striata, the optimal weaning procedure is to begin at 17 days after hatch (dah) and wean the fish at 10% replacement of live feed with formulated feed per day. However, for C. micropeltes, the optimal procedure is to wait until 40 dah to begin weaning and then to wean the fish with a 10% replacement of live feed with formulated feed every 3 days. These results should enable farmers to domesticate snakehead culture in Vietnam and Cambodia and eliminate reliance on fish captured from the wild as both seed and feed.     

关于黄鳝的养殖技术黄鳝生态养殖技术

养殖黄鳝是一项经济效益较高的项目,本人从1994年开始养殖黄鳝,摸索出黄鳝的生态养殖技术,是一项低风险、低成本、高成活、大规格的养殖方法.现将此项技术介绍如下.     

池塘中设置网箱繁育乌鳢苗种试验

近年来,随着乌鳢养殖业的迅速发展,苗种的需求量越来越大,为解决乌鳢人工繁殖过程中“催产孵化易,苗种培育难”的问题,我们经过两年的试验,成功地摸索出了一套网箱繁育乌鳢苗种的可行性技术,现总结如下。     

Maximum handling size,prey size and type selection by snakehead (Channa argus) feeding on juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)

Laboratory predation trials were conducted to investigate maximum handling size, prey size and type selection by small (35–37 cm in total length, L_T), medium (43–46 cm L_T) and larger (58–60 cm L_T) snakehead (Channa argus) when feeding on a wide size (9–34 mm in carapace width, C_W) range of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis). The maximum handling size of predator feeding on crabs monotonically increased with predator L_T and mouth gape width, G_W. Snakehead with at least 16.0 cm L_T or 27.7 mm G_W would be capability to consume the smallest size group of crabs, whereas the predator with 72.6 cm L_T or 63.4 mm G_W would be capability to consume all size groups of crabs in these trails. Prey‐size selection trials showed that snakehead has a high preference to the small‐sized crabs, and lower preference to the medium or large size crabs. The preference index was significantly affected by prey size and prey size × predator size interaction, however, was not affected by predator size. In prey type experiments, snakehead consumed lower proportions of juvenile crabs when fed on the crab and crucian carp than when fed on only the crab, which suggests alternative fish prey may reduce predation risk of the crab by snakehead in nature. These results could be useful for improving the fishery management and release strategies for the crab.