鱼类皮肤免疫应答及蛋白质组学

正鱼类皮肤作为黏膜免疫系统的重要组成部分,也是阻止病原微生物进入体内的第一道防线[1]。鱼类皮肤黏膜免疫系统不仅对宿主防御病原侵入是必要的,而且对水产养殖疫苗应用也十分重要[2-3]。近年来,与系统免疫相比而言,鱼类皮肤黏膜免疫应答研究备受关注[4-6]。笔者针对鱼类皮肤免疫应答的分子机制及蛋白质组学研究进行简要综述,以期为鱼类病害的预防和治疗提供科学参考。     

镉对大弹涂鱼肝脏超氧化物歧化酶活性的影响

研究了不同质量浓度镉对大弹涂鱼肝脏超氧化物歧化酶SOD活性的影响。试验结果表明,当曝露于质量浓度为0.05、0.5 mg/L镉中3 d时,大弹涂鱼肝脏SOD活性被显著诱导,当曝露于质量浓度为5.0 mg/L镉中1 d时即被显著诱导;随着曝露时间的延长,各含量组肝脏SOD的活性均不同程度下降,但中低质量浓度条件下仍表现为诱导,而高质量浓度组SOD活性10 d后即明显下降,呈现中毒抑制现象。     

大弹涂鱼池塘养殖试验

2004、2005年在面积分别为26亩(15亩=1hm2,下同)和19亩的2个池塘进行大弹涂鱼养殖试验。2004年5月和2005年5月分别放养体长2～3cm的鱼苗15.2万尾和28万尾。经过精心管理,分别收获规格为40～45尾/kg的商品鱼2987kg和5305kg,亩产93.3～117.9kg,成活率达80.9%～84.2%,投入产出比1:1.75～2.04,效果良好。     

大弹涂鱼池塘养殖技术

在面积为1公顷的池塘投放全长为2.5～3.0cm的大弹涂鱼苗60000尾,养殖密度为6尾/m2。经过1年的养殖,共收获成鱼1147.5kg,成活率达85%,体长9.30～14.50cm,平均体长11.80cm,体重11.2～38.3g,平均体重22.50g。     

大弹涂鱼池塘高效养殖试验

利用面积0．333hm^2和0．667hm^2的2口池塘进行大弹涂鱼高效养殖试验。2007年4月,2口池塘共放养规格为150-220尾／kg的大弹涂鱼苗种120000尾。采用池外源预先肥水养藻,定向培养生物饵料,结合池内追肥繁藻和补充投喂人工饵料技术。以满足大弹涂鱼养殖饵料营养的需求。经过精心管理,至收获时商品鱼个体重16-23g／尾,产量为2044．5kg。平均产量136．30kg／667m^2,成活率达85．2％,投入产出比1：2．05,效果显著。     

大弹涂鱼血细胞发生的研究

通过对大鲜涂鱼血液、肾脏、脾脏组织涂片的观察，发现其肾脏、脾脏内白细胞的发育大致经过了3个阶段，即原始阶段、幼稚阶段、成熟阶段。造血母细胞从造血器官释放入外周血中有一成熟过程。着重描述了大弹涂鱼的红细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞发生过程中各阶段细胞的形态特征。     

大弹涂鱼室内、外结合人工育苗试验

2009年4月在380m2的土池投放大弹涂鱼2龄亲鱼35kg,5月23日-29日和6月6日-11日先后产出两批仔鱼,共260万尾,于5月29日和6月11日晚采用管道通过自然落差移到室内育苗池,经45d-47d培育,育出幼鱼79.1万尾,平均全长为22.71mm,总成活率30.42%。试验表明把土池产出的仔鱼引到室内进行培育,是突破大弹涂鱼生产性育苗难关的有效方案。     

大弹涂鱼的年龄、生长和生殖力研究

本文研究了大弹涂鱼胸鳍第二支鳍骨的年轮特征、渔获物年龄组成和体长组成,并结合生物学资料,对体长与支鳍骨骨长、体长与体重、肥满度、生长指标和个体生殖力作了分析。生长参数拟合的生长方程符合其生长规律。依据其生态特征,大弹涂鱼应属于r型选择的生活史类型。文中讨论了资源的合理利用和增养殖问题,认为大弹涂鱼在对虾池内混养会提高虾池的综合效益。     

病原性河流弧菌对青石斑鱼体表黏液黏附特性研究

采用3H-TdR同位素示踪法研究了河流弧菌对不同处理后的青石斑鱼表皮黏液的黏附作用。结果显示：青石斑鱼表皮黏液经40、60和80 ℃热处理10 min后河流弧菌的黏附率出现显著性升高,而100 ℃处理10 min则能极显著降低河流弧菌的黏附作用;蛋白酶K和胰蛋白酶处理黏液对河流弧菌的黏附作用没有显著影响,高碘酸处理则能极显著提高河流弧菌的黏附率;8种碳水化合物中的葡萄糖、甘露糖、甘露醇、麦芽糖能极显著促进河流弧菌的黏附作用,乳糖、果糖及蔗糖能显著性促进河流弧菌的黏附作用;半乳糖则没有显著性影响;高浓度的细胞表面提取物能显著抑制河流弧菌的黏附作用,但较低浓度的细胞表面提取物反而有一定的促进作用;青石斑鱼表皮黏液经Sephadex G-100分离得到3个洗脱峰,河流弧菌对第1个洗脱峰的黏附作用最强。本文研究结果表明,病原性河流弧菌对青石斑鱼表皮黏液有较强的黏附作用;青石斑鱼表皮黏液中存在特异性黏附受体;黏液中的主要黏附受体是热稳定性较高、耐蛋白酶K和胰蛋白酶的大分子物质。     

大弹涂鱼白细胞介素-8基因分子进化及不同病原体刺激对其表达的影响

实验从大弹涂鱼皮肤组织转录组中筛选出大弹涂鱼IL-8基因,并分析了其序列特征,构建了系统发生树,评估了IL-8基因在健康个体不同组织中的表达差异,以及在不同病原体刺激下IL-8基因在机体主要免疫器官肝脏和脾脏中的表达情况。结果显示,该基因的开放阅读框由306个碱基组成,编码101个氨基酸残基,包含典型的由18个氨基酸残基组成的信号肽,和1个由62个氨基酸残基组成的SCY结构域,该结构域还包含了4个保守的半胱氨酸残基,分别为Cys-30、Cys-32、Cys-57和Cys-73。大弹涂鱼IL-8氨基酸序列中的受体结合位点基序ELR (Glu-Leu-Arg)被Asn-Ser-His (NSH)取代,系统进化分析表明,纯化选择影响了鱼类该基序的多样性,且IL-8基因在大弹涂鱼乃至硬骨鱼中不可取代。荧光定量实验结果显示,IL-8基因在大弹涂鱼的健康组织中广泛表达,在鳃和脑中表达量最高。细菌和poly(I∶C)注射实验表明,在受到感染后,肝、脾和脑组织中IL-8的表达量均上调,说明IL-8基因在大弹涂鱼肝、脾和脑组织的炎性反应和免疫应答中起到了重要作用,为大弹涂鱼免疫基因的后续研究提供了参考。     

鲫皮肤蛋白质组双向电泳与部分蛋白点的质谱鉴定

为了建立鱼类皮肤蛋白质组双向电泳图谱及质谱鉴定,以鲫为实验动物,采用蛋白双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术,进行鲫皮肤的蛋白质组学研究。结果表明,当上样量为800μg,采用18 cm、p H3~10 IPG胶条,等电聚焦80 000 Vh,2-DE图谱检测为214个皮肤蛋白点,匹配率达88%;对其中31个蛋白点进行MS/MS鉴定为22种蛋白,包括肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋白、锌指蛋白585B、效应蛋白Rab15、卷曲螺旋结构域蛋白168、NCK1相关蛋白,肌酸激酶、烯醇化酶、丙酮酸脱氢酶、腺苷酸激酶同工酶等;进行蛋白功能聚类(GO)分析发现12种生物学过程,主要参与代谢、细胞、有机体、免疫应答、生物调节和信号等过程。本研究首次初步揭示鲫皮肤蛋白质组及分子机制,以期为鱼类病害的预防和治疗提供科学参考。     

大弹涂鱼仔稚鱼和早期幼鱼的消化酶活性

采用酶学分析的方法,研究了大弹涂鱼前期仔鱼、后期仔鱼、稚鱼和早期幼鱼发育过程中胰腺酶、肠酶和胃蛋白酶活性的变化。结果表明,(1)4种胰腺酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和羧肽酶A)和8种肠酶(麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖酶、纤维二糖酶、碱性磷酸酶、氨基肽酶和γ-谷氨酰转肽酶)的比活力均在仔鱼期较高,稚鱼期降至最低,早期幼鱼则急剧上升,而每尾鱼酶的总活力却随着幼体的发育而逐渐增加;(2)胃蛋白酶活性在后期仔鱼才开始检测到,此后一直呈显著上升趋势;(3)早期幼鱼肠部位的4种胰腺酶活性分别占其酶总活性的百分比均显著高于稚鱼期;(4) 稚鱼期仅3种肠酶(麦芽糖酶、纤维二糖酶和γ-谷氨酰转肽酶)高度富积在肠刷状缘膜上,而早期幼鱼除蔗糖酶外的7种肠酶在肠刷状缘膜上的富集系数均大于5.1。由此得出结论,(1)在仔鱼期,蛋白质的消化是依靠胰腺酶进行的,进入稚鱼期,胃蛋白酶开始对蛋白质的消化起重要作用;(2)在早期幼鱼,胰腺分泌机制及肠细胞已完全成熟,标志着成鱼的消化模式的形成。     

牙鲆皮肤黏液免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸铵分步盐析结合Sephacryl S-300凝胶过滤层析及DEAE Sepharose离子层析法,对牙鲆皮肤黏液中的免疫球蛋白(Ig)进行了分离纯化,并通过SDS-PAGE及Western-blotting技术对纯化蛋白的部分特性进行了分析。结果表明,30%、50%饱和硫酸铵分步盐析可以去除牙鲆黏液中除Ig外的很多杂蛋白,得到粗提黏液Ig;再经Sephacryl S-300纯化,Ig纯度较高,其中含有72和26 ku的条带;DEAE Sepharose层析法可进一步纯化Sephacryl S-300柱层析的产物,所提取黏液Ig经SDS-PAGE检测,只含有72和26 ku两个条带,初步认为是牙鲆黏液Ig的重链和轻链。Western-blotting结果显示,抗牙鲆血清Ig单克隆抗体可与黏液Ig重链72 ku条带发生发应。     

急性氨氮暴露对大弹涂鱼炎性反应相关基因表达的影响

为研究急性氨氮胁迫对大弹涂鱼炎性反应相关基因表达的影响,实验挑选初始体质量为(15.14±0.05) g的健康大弹涂鱼幼鱼180尾,进行96 h的急性氨氮胁迫实验。结果显示,大弹涂鱼96 h氨氮半致死浓度为8.99 mg/L总氨氮(0.11 mg/L非离子氨,T-AN);氨氮胁迫后TNF基因的mRNA表达量分别于12和96 h时显著上调,96 h时表达量达到0 h时的2倍;IL-1基因的mRNA表达量12 h时显著上调,为0 h时表达量的6倍;氨氮胁迫后IL-6基因的mRNA表达量分别于12和96 h时显著上调,表达量达到0 h时的1.5倍;氨氮胁迫后IL-8基因的mRNA表达量在24 h时出现显著下调。研究表明,大弹涂鱼96 h氨氮半致死浓度为8.99 mg/L总氨氮;半致死浓度的氨氮胁迫48 h后,TNF、IL-1、IL-6和IL-8基因的mRNA表达量持续升高,推测过度炎性应激可能是导致鱼类氨中毒死亡的原因之一。     

大鲵皮肤cDNA文库ESTs分析及Dynll 2基因的分离与表达

以本实验室构建的大鲵皮肤cDNA文库为材料,通过文库质量检测、随机测序、ESTs拼接、COG软件进行基因注释等对文库进行了分析,并从中分离获得了大鲵胞质动力蛋白轻链2(dynein light chain,LC8-type 2,Dynll 2)基因的cDNA序列,对Dynll 2基因进行了生物信息学分析及组织表达研究。结果表明,本实验室构建的大鲵cDNA文库初级库容为1.50×10⁶ cfu,文库重组率为94.8%,插入片段平均长度约为1 kb。400个随机克隆测序共获得343个有效ESTs,其中214条ESTs序列E值＜10^-6,经COG软件归为9大类,其中与分泌蛋白、细胞代谢、细胞骨架以及信号转导相关的基因表达量最高,分别为31.3%、14.0%、13.0%和12.6%。表明大鲵皮肤分泌活动强烈,代谢旺盛,这和大鲵皮肤发挥免疫、呼吸以及渗透压平衡等生理功能相一致。获得的大鲵Dynll 2基因全长为682 bp,其中5′-UTR为57 bp,3′-UTR为313 bp,生物信息学分析表明,该基因编码104个氨基酸,分子量为12.03 ku,等电点pI值为7.05。Dynll 2蛋白在88~104处有由里向外和由外向里的2个跨膜螺旋区,且二级结构以α—螺旋为主;在69~87处有典型的“ZnFC2H2”结构模体;经比较,其三级结构与鼠Dynll 2蛋白相似。Dynll 2蛋白的进化分析表明,大鲵与无尾两栖类相比,更接近陆生动物。荧光定量实验表明,大鲵Dynll 2基因在肌肉中高表达,在其他组织中低度表达。     

短小芽孢杆菌X93及胞外产物抑菌活性的研究

从健康养殖大黄鱼肠道中筛选出对病原弧菌有拮抗作用的潜在益生菌株X93,利用细菌快速鉴定系统和16S rDNA方法进行细菌种类鉴定;通过点种法对其抗菌谱进行测定;采用平板扩散法,研究了培养时间、温度、盐度、蛋白酶K和Fe3+等因素对其胞外产物抑菌活性的影响。结果显示:该菌株为短小芽孢杆菌(GenBank accession No.HM137033);对20株病原指示菌中的13株均产生不同程度的抑制作用,抗菌谱较广;菌株培养48 h后的胞外产物抑菌作用最强;在pH为7时,抑菌活性最大;达到最大抑菌活性的温度和盐度分别为28 ℃、5;蛋白酶K和不同浓度的FeCl3均会降低其抑菌活性。该菌对病原弧菌、迟缓爱德华菌和嗜水气单胞菌等水产上常见主要致病菌有良好的拮抗效果,且具有抑菌作用的胞外产物对温度、盐度和Fe3+有一定的适应范围,适宜作为益生菌株,有望在实际养殖环境中得到应用。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

大弹涂鱼TLR基因分子进化研究及其在鳗弧菌胁迫后的表达分析

大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)是一种生活在潮间带的淤泥滩和红树林等两栖环境中的鱼类,其免疫系统面临比水生生活更大的选择压力。Toll样受体基因(简称TLR)是重要的先天免疫成员,一直是鱼类分子免疫学的研究热点之一。为了探究大弹涂鱼TLR基因是否因为其独特的生活环境而产生适应性进化以及其TLR基因在受到细菌攻击后的免疫应答模式,本研究从大弹涂鱼皮肤转录组中获得了TLR5, TLR8和TLR9完整序列以及TLR3和TLR7部分序列,采用分子生物信息学对大弹涂鱼TLR5, TLR8和TLR9基因序列以及氨基酸序列进行了分析,并根据所构建的系统发育树对5个TLR基因进行了分子进化分析,采用荧光定量PCR方法对大弹涂鱼5个TLR基因的组织表达分布和鳗弧菌攻击后5个TLR基因的免疫应答模式开展了研究。结果显示, TLR5基因全长3071 bp,包括长度为2646 bp的编码区,共编码882个氨基酸;TLR8基因全长3175 bp,包括长度为3033 bp的编码区,共编码1011个氨基酸;TLR9基因全长3398 bp,编码区长度为3093 bp,共编码1031个氨基酸。大弹涂鱼3个TLR基因与其他物种的TLR基因结构相似,具有高度保守性。位点模型结果表明,鱼类TLR3, TLR5和TLR8是高度保守的,而TLR7和TLR9在长期进化过程中产生了适应性进化;而进化枝-位点模型结果表明,为了适应更加复杂多变的两栖环境,大弹涂鱼TLR9基因可能产生了适应性进化。大弹涂鱼5个TLR基因在8个健康组织(肠,眼,肾,肝,脑,肌肉,脾和皮肤)中均有表达,在肝脏和脾脏中的表达量较高。在受到鳗弧菌(Vibrio anguillarum)攻击后的免疫表达模式表明了大弹涂鱼5个TLR基因在应对细菌入侵时起到了重要作用。