斜带石斑鱼溶藻弧菌病的研究

从患病的斜带石斑鱼肝和肾组织分离的两株病原菌,进行纯化培养、人工感染、VITEK-AMS-32自动微生物分析鉴定及药敏试验,经形态和生理生化测定,确定为溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。组织病理变化主要表现为鳃、肝和肾细胞变性、坏死,病变组织炎性细胞浸润,呈变质性炎症。     

斜带石斑鱼病原菌(哈维氏弧菌)的分离与鉴定

从患病斜带石斑鱼 (Epinepheluscoioides)肝脏组织分离到EcGY0 2 0 4 0 1菌株 ,经人工感染、回归感染实验证实为致病菌。通过API系统和菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定以及 16SrRNA测序分析等综合鉴定 ,Ec GY0 2 0 4 0 1菌株为弧菌属哈维氏弧菌 (Vibrioharveyi) ,其半致死剂量LD50 为 2 .7× 10 6CFU/g鱼体重。药敏试验结果表明 ,EcGY0 2 0 4 0 1菌株对利福平、四环素、喹诺酮类及头孢曲松等抗生素较为敏感     

副溶血弧菌对斜带石斑鱼血清中一氧化氮合酶活力的影响

为了研究感染副溶血弧菌对斜带石斑鱼体内一氧化氮合酶活力的影响 ,分别对斜带石斑鱼腹腔注射浓度为 5× 10 8cfu/ml、5× 10 7cfu/ml、5× 10 6cfu/ml的副溶血弧菌悬浮液 ,在注射后 2 4h、4 8h、72h、12 0h和 192h尾部取血 ,测定其血清中NOS活力的变化情况。结果表明 ,注射副溶血弧菌后斜带石斑鱼血清中NOS活力显著高于对照组 ,并且高浓度组NOS活力显著高于低浓度组 ,证明注射副溶血弧菌可以诱导斜带石斑鱼体内NOS活力的升高。     

臭氧对斜带石斑鱼胚胎发育和初孵仔鱼的毒性效应

为了评价臭氧消毒技术及其对石斑鱼(Epinephelus)潜在的毒性, 首先评价了两种质量浓度(0.05 mg/L和0.30 mg/L)臭氧对亚硝酸盐和弧菌的水处理效果, 并以斜带石斑鱼(E. coioide)受精卵为实验材料, 探讨臭氧对胚胎发育和初孵仔鱼的毒性作用。结果显示, 臭氧的水处理效果良好, 0.30 mg/L的臭氧在3 h内对水中亚硝酸盐的去除率可达72.29%; 0.05 mg/L的臭氧处理20 min后也能完全杀灭弧菌。但高浓度臭氧(0.30 mg/L)对胚胎发育具有一定的毒性, 会造成胚胎油球数目增多、萎缩、解体和死亡, 而低浓度组(0.05 mg/L)臭氧处理后22 h胚胎孵化率高达(87.14±7.20)%, 与对照组无显著差异。与胚胎相比, 初孵仔鱼对臭氧更加敏感, 0.05 mg/L的臭氧处理24 h也会导致初孵仔鱼的全部死亡。本研究结果旨在为石斑鱼育苗及养殖过程中正确使用臭氧消毒技术提供重要的数据参考和理论依据。

     

云芝多糖和副溶血弧菌灭活苗对斜带石斑鱼免疫功能的影响

采用注射云芝多糖和副溶血弧菌灭活苗的方法免疫斜带石斑鱼后,测定了受免鱼的吞噬细胞的吞噬活性、杀菌功能和免疫保护率。结果表明,云芝多糖组在第3天,吞噬细胞的吞噬百分比(PP)达到峰值(90%),显著高于对照组(P0.05),然后开始下降,到第7天即与对照组相当(P0.05);30 m in和60 m in的杀菌率显著提高(P0.05)。灭活苗组和云芝多糖+灭活苗组的PP值和杀菌率显著高于对照组(P0.05),并维持在较高水平,但2组之间差异不显著(P0.05);用副溶血弧菌攻毒后,斜带石斑鱼的免疫保护率达87.6%。由此可见,灭活苗不仅能提高斜带石斑鱼的特异性免疫力,而且也能增强吞噬细胞的吞噬和杀菌活性等非特异性免疫力。     

一株斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）病原菌的分离与鉴定

2011年7月,福建省晋江某养殖场养殖的斜带石斑鱼( Epinephelus coioides )发病,病鱼体重3~10 g,症状为鱼体色变深,拒食,离群缓慢游动,背鳍下方局部鳞片脱落、表皮溃烂,肝脏点状发红。2011年7月从濒死病鱼肝脏、肾脏中分离到2株细菌,分别命名为201107-I与201107-II,经生理、生化指标和16S rRNA 基因鉴定,这两株均为哈维氏弧菌( Vibrio harveyi )。毒性实验发现这两株菌都能引起斜带石斑鱼表皮溃烂症,其中201107-II毒性较强,被用于后续感染实验。通过肌肉注射、腹腔注射与创伤浸浴3种方式进行回归感染实验,得到3种方式对石斑鱼的半致死量LD50分别为4．3×104、2．9×105和5．4×106 cfu/g鱼体重。从人工感染的石斑鱼肾脏中再次分离到该菌,经生理、生化指标和16 S rRNA 基因鉴定,为同株菌。药敏实验结果表明,该菌株对红霉素、大观霉素、氯霉素等16种抗生素高度敏感,对呋喃唑酮、克拉霉素、环丙沙星等9种抗生素中度敏感,对苯唑西林、青霉素G、万古霉素等13种抗生素不敏感。本研究对石斑鱼病害防治与健康养殖具有一定的指导意义。     

恩诺沙星诱导溶藻弧菌耐药和交叉耐药的研究

自收集于海南海水养殖区域内的溶藻弧菌中筛选恩诺沙星敏感株,在含亚抑菌质量浓度恩诺沙星的培养基上进行质量浓度递增法体外诱导,探究耐药性的发生状况,比较诱导耐药前后诱导菌对诱导药物和6种非诱导药物的最小抑菌质量浓度,并在不含药物的培养基上连续传代考察诱导后的耐药株遗传稳定性.试验结果表明,30株养殖源溶藻弧菌中筛选出24株...     

斜带石斑鱼池塘生态育苗技术

本文主要介绍了斜带石斑鱼池塘生态育苗技术操作要点,并对育苗过程中的几个常见问题做了简要综述。     

网箱养殖大黄鱼弧菌病的中草药防治

测定了15种中草药对大黄鱼病原菌———溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的最低抑菌质量浓度(MIC)以及最低杀菌质量浓度(MBC)。试验结果表明:15种中草药对溶藻弧菌都有不同程度的抑制作用,其中以石榴皮、地榆、五味子、大黄等4种药物的抑菌能力最强,MIC值分别为为1 56、1 56、3 12、3 12g L;MBC均为6 25g L,可作为防治该病的有效药物。     

梭子蟹溶藻弧菌病的初步研究

2005～2006年,昌邑池塘养殖梭子蟹发生被称为"牙膏病"的疾病,并导致大量死亡。发病时间主要在7～9月份的高水温期,病蟹典型症状是肌肉白浊、无弹性、呈不透明的乳白色。从病蟹的肌肉、肠道、胃、眼球、肝胰腺均分离到单一形态的微生物,经生理生化鉴定为溶藻弧菌。人工感染实验发现,其对健康梭子蟹具有致病性,出现与自然发病蟹相同的症状,并在人工感染病蟹中分离出同样性状的菌株,证实其为该病病原菌。     

饲料精氨酸水平对斜带石斑鱼蛋白质沉积和相关免疫基因表达的影响

为研究饲料中不同水平精氨酸对斜带石斑鱼蛋白质沉积和相关免疫基因表达的影响,实验配制7种等氮等脂的饲料,精氨酸浓度分别为2.13%、2.42%、2.71%、2.95%、3.20%、3.48%和3.74%。随机挑选健康的斜带石斑鱼[初始体质量(80.11±0.03) g]分成7组,每组设3个重复,每个重复25尾鱼,进行为期10周的养殖实验。结果显示,精氨酸浓度为2.71%组鱼体增重率和特定生长率显著高于2.13%和2.42%组,饲料系数显著低于2.13%组。2.71%组的蛋白质效率显著高于2.13%组和3.48%组,2.71%组的蛋白质沉积率与2.95%组无显著差异,显著大于其他组。以增重率为依据,经折线模型拟合得出,斜带石斑鱼对饲料中精氨酸的最适需求量为饲料的2.73%(饲料蛋白质的5.40%)。斜带石斑鱼血清胰岛素在3.20%组达到最大值,与3.48%组差异不显著,显著高于其他组。肌肉雷帕霉素靶蛋白(TOR) mRNA水平3.48%组显著高于2.13%、2.42%及2.71%组。2.42%组后肠b0,+AT基因表达量最高,显著高于其他各组。2.95%和3.20%组肾脏b~(0,+)AT基因表达量差异不显著,显著高于其他组。研究表明,适宜水平的饲料精氨酸可以刺激斜带石斑鱼胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的分泌,进而促进蛋白质的合成;提高鱼体肠道、肾脏及肝脏相关免疫基因的表达,提高机体免疫力,促进鱼体生长。     

溶藻弧菌外膜蛋白(Va-OMP)的免疫原性及免疫保护性

利用初步制备的溶藻弧菌外膜蛋白（outer membrane protein of Vibrio alginolyticus, Va-OMP）、溶藻弧菌蛋白分子量58 kD外膜蛋白（Va-OMP58）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus, Va）灭活菌苗、溶藻弧菌脂多糖（lipopolysaccharides of Vibrio alginolyticus, Va-LPS）菌苗等进行主动保护性和被动保护性的实验比较,VaOMP、Va-OMP58免疫组小鼠免疫后用活菌攻击,免疫保护率为62.5%～86.7%,而Va-LPS组和Va灭活菌苗组的免疫保护率为50%～62.5%,对照组的免疫保护率仅为6.7%。用不同抗血清免疫小鼠,活菌攻击后,Va-OMP组存活率达到53.3%和66.7%,VaOMP58组次之,存活率为40%和50%,Va灭活菌组的存活率为33.3%和46.7%,对照组为13.3%。与对照组相比较,Va-OMP组差异较显著,保护效果较好。溶藻弧菌外膜蛋白和蛋白分子量58 kD外膜蛋白的保护性效果高于溶藻弧菌灭活菌苗和溶藻弧菌脂多糖的保护性效果,证明外膜蛋白（outer membrane protein, OMP）具有较强的免疫原性。迟发性超敏反应试验也证明,OMP能诱发变态反应,间接证明OMP具有较强的引起细胞介导免疫反应的能力。因此实验证明,Va-OMP、Va-OMP⁵⁸是能在小鼠产生体液免疫和细胞介导免疫的保护性抗原。     

斜带石斑鱼IgM、IgZ和IgD重链基因的克隆

应用RACE方法获得斜带石斑鱼膜结合型免疫球蛋白M(membrane-bound immu-noglobulin M,mIgM),膜结合型免疫球蛋白D(mIgD),分泌型免疫球蛋白Z(secretory immu-noglobulin Z,sIgZ)的重链基因。斜带石斑鱼膜结合型IgM重链恒定区包含3个恒定区结构域(μ1,μ2,μ3)以及两个跨膜外显子(TM1,TM2),TM1外显子与μ3结构域末端相连接。氨基酸序列相似性分析结果显示,斜带石斑鱼mIgM各恒定区与牙鲆mIgM恒定区相似性最高,为53%~78%。mIgD的cDNA全长为3 375 bp,开放阅读框包含3 006 bp,其恒定区由1个μ1外显子,7个δ外显子以及跨膜区组成。斜带石斑鱼IgD恒定区与鳜IgD各恒定区氨基酸序列相似性最高,δ1~δ7的相似性分别为75.5%、75.8%、65.4%、76.6%、88.1%、90.6%、82.8%,TM结构域为82.7%。sIgZ的基因结构与其他硬骨鱼类sIgZ的结构相似,包括4个外显子和3个内含子,内含子长度分别为222、129和458 bp。利用半定量PCR分别检测了这3种基因在斜带石斑鱼各器官/组织中的表达,发现mIgM在头肾、肾脏、脑、脾脏、肠、鳃、心脏和胸腺中均有表达;mIgD的mRNA在头肾、肾脏以及胸腺中有较高的表达,在肠中表达量较低;sIgZ mRNA主要分布于淋巴组织如头肾、肾及脾脏中,而在鳃、心脏和胸腺中的丰度较低。     

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因表达和间接ELISA检测方法的初步建立

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,数量居海洋类弧菌之首,其快速检测具有重要意义。以溶藻弧菌国内标准株ATCC17749基因组DNA为模板,PCR扩增出外膜蛋白OmpK基因,将其克隆入表达载体pET-28a中,获得重组质粒pET-28a-OmpK,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列开放读码框正确且与已发表的OmpK结构编码序列完全一致。将重组质粒pET-28a-OmpK转化大肠杆菌BL21 pLys E,高效表达重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠所得的高免血清能外膜蛋白OmpK特异性结合,表明体外表达的重组蛋白OmpK具有良好的免疫原性和反应原性。利用该抗溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的抗血清建立了间接ELISA检测方法,检测灵敏度为10⁴ CFU/mL,能特异性检测出溶藻弧菌,与其他菌株无交叉反应。     

不同盐度对斜带石斑鱼幼鱼血清离子浓度和激素水平的影响及其与鳃MRCs渗透调节功能的关系

为探究不同盐度对斜带石斑鱼幼鱼血清离子浓度和激素水平的影响及其与鳃线粒体丰富细胞(MRCs)渗透调节功能关系,实验将暂养于盐度为30的水体中的斜带石斑鱼幼鱼直接转移至盐度分别为5、10、20和30(对照组)的水体中,于7和15 d分别检测血清Na~+、K~+、Cl~–浓度和血清皮质醇(COR)水平,并于第15天观察幼鱼鳃MRCs分布和结构的变化。结果显示,随盐度升高,幼鱼血清Na~+、Cl~–浓度显著上升,而K~+浓度无显著变化;COR水平在盐度5和10实验组显著高于盐度20和对照组;随盐度上升,鳃MRCs体积增大,数量增多,且盐度20和对照组鳃MRCs体积显著大于盐度5和10实验组;鳃MRCs表面存在一个特殊的顶膜结构,在不同盐度下呈现不同形态:盐度5和10实验组中鳃MRCs顶膜开口较大,且其表面存在大量的微绒,而盐度20实验组和对照组中鳃MRCs的顶膜向内深陷形成了一个顶隐窝,开口较小,且其表面没有微绒毛。研究表明,斜带石斑鱼幼鱼鳃MRCs在盐度5的水体中可以很好地发挥渗透调节功能,使幼鱼在盐度5的水体中存活。     

溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护研究

为研究溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护作用,实验构建了重组真核表达质粒pcDNA-flaC并将该质粒肌肉注射红笛鲷,采用PCR、RT-PCR、ELISA和攻毒试验等方法检测了该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达和对红笛鲷的免疫保护.PCR结果显示,免疫接种7和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7天、14天和28天,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达.ELISA结果表明,鱼血清内产生了抗FlaC蛋白的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体.攻毒实验表明,免疫后的红笛鲷能较好地抵抗致病性溶藻弧菌的感染.结果表明,质粒pcDNA-flaC可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的疫苗候选物.     

不同储存条件的鱼油对斜带石斑鱼幼鱼生长性能和抗氧化指标的影响

为研究不同储存时间、温度、抗氧化剂添加量处理的鱼油对斜带石斑鱼生长性能和抗氧化指标的影响,实验鱼油采用如下条件进行氧化处理:储存温度:4℃、环境温度(ambienttemperature,AT):(31.5±3.5)℃;抗氧化剂添加量:30 mg/kg(EQ)、300 mg/kg(HEQ);储存时间:45、90和135 d。根据鱼油储存方式的不同共分为14个处理组,分别为T_(F+EQ)(正对照组,新鲜鱼油+EQ)、T_F(负对照组,新鲜鱼油未加EQ)、T_(4℃+45d+EQ)、T_(4℃+45d+HEQ)、T_(4℃+90d+EQ)、T_(4℃+90d+HEQ)、T_(4℃+135d+EQ)、T_(4℃+135d+HEQ)、T_(AT+45d+EQ)、T_(AT+45d+HEQ)、T_(AT+90d+EQ)、T_(AT+90d+HEQ)、T_(AT+135d+EQ)、T_(AT+135d+HEQ),配制等氮等脂饲料。选择健康幼鱼[初重(18±0.02)g]进行实验,养殖8周。结果显示,T_(4℃+45d+EQ)组增重率与T_(F+EQ)组相比无显著差异,但是显著高于T_(AT+135d+EQ)组。T_(4℃+45d+EQ)、T_(4℃+45d+HEQ)、T_(AT+45d+EQ)和T_(AT+45d+HEQ)组饲料系数较低,与T_(F+EQ)、T_F组比差异不显著,但显著低于T_(AT+135d+EQ)、T_(AT+135d+HEQ)组。T_(F+EQ)、T_(4℃+45d+HEQ)组细胞结构明显,细胞内脂肪粒大小正常,T_(AT+135d+EQ)和T_(AT+135d+HEQ)组鱼油氧化程度较高,肝细胞中脂肪淤积现象明显。T_(4℃+135d+EQ)、T_(AT+135d+EQ)和T_(AT+135d+HEQ)组的CAT活力显著高于T_(F+EQ)、T_F组,SOD和GSHPx均在T_(AT+135d+EQ)组达到最高且显著高于T_(F+EQ)、T_F组。T_(4℃+45d+EQ)、T_(4℃+45d+HEQ)、T_(AT+45d+EQ)和T_(AT+45d+HEQ)组肝脏中MDA含量与T_(F+EQ)、T_F组对比无明显差异,但是显著低于其余各组。研究表明,T_(4℃+45d+EQ)、T_(4℃+45d+HEQ)、T_(AT+45d+EQ)和T_(AT+45d+HEQ)组斜带石斑鱼鱼油生长性能和抗氧化指标相对良好,T_(4℃+45d+EQ)和T_(4℃+45d+HEQ)组更优于T_(AT+45d+EQ)和T_(AT+45d+HEQ)组,说明短期、添加抗氧化剂有利于鱼油的保存,4℃比环境温度保存效果更好。     

斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法的建立

本研究以斜带石斑鱼肝细胞为实验对象,在不同培养条件下进行原代培养,旨在探讨稳定可靠的斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法。采用组织块分离法和胰蛋白酶(含EDTA)消化法分离肝细胞,并通过密度梯度离心法分离纯化肝细胞,细胞悬液于DMEM/F-12、M199和L-15培养液中培养;细胞活力及数量采用血球计数板计数,并通过MTT法测定细胞增殖率;同时,测定不同时间培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、白蛋白(ALB)和尿素氮(BUN)的含量,以分析肝细胞生长状态。结果表明,组织块方法不适于斜带石斑鱼肝细胞的培养,未见细胞从组织块中迁出,而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果,细胞产量达到1.6×108个/g肝重,活细胞数达到95%;L-15培养基细胞生长明显优于DMEM/F-12和M199培养基;启动原代培养的48~72 h阶段肝细胞生长代谢旺盛,培养上清液中LDH活性显著降低,ALB和BUN含量显著升高。结果显示,0.25%的胰蛋白酶常温消化法适合斜带石斑鱼肝细胞的分离,斜带石斑鱼肝细胞原代培养的最适培养基为L-15培养基,肝细胞在启动原代培养的48~72 h生长代谢旺盛。     

溶藻弧菌诱导对三疣梭子蟹血淋巴非特异性免疫水平的影响

以平均体质量为(162±26)g雌性三疣梭子蟹为试验对象,注射组从游泳足第一关节基膜注射200 μL浓度为2.4×107 CFU/mL的溶藻弧菌菌悬液,对照组注射等量无菌生理盐水.各组在注射0、24、48、72、96h后随机取9只三疣梭子蟹,从游泳足基膜部位抽取血淋巴,测定血淋巴的血细胞总数、大颗粒细胞比例、血清蛋白、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、一氧化氮和诱导型一氧化氮合成酶等非特异性免疫指标.结果表明,遭受低剂量的溶藻弧菌侵袭后,三疣梭子蟹血细胞总数迅速降低(P＜0.05),与对照组相比降低36％,而大颗粒细胞比例则先上升(P＜0.05),72 h后恢复至正常水平;血清蛋白含量则无明显变化;血清中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活性也迅速增加,并分别在24、72 h达到峰值(P＜0.01,P＜0.05),在96h后两种酶的活性均恢复至对照组水平;血清中一氧化氮含量及诱导型一氧化氮合成酶活性则稳步增加,并在96 h达到峰值(P＜0.01).研究证实低剂量的溶藻弧菌能刺激三疣梭子蟹调动血细胞、酸、碱性磷酸酶、一氧化氮合成酶系统进行免疫防御,但是各非特异性免疫指标大多具有明显的时间效应,响应速度有较大差异.     

活性和热灭活原籍嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)SE6对斜带石斑鱼幼鱼生长性能和免疫功能的影响

为探讨灭活益生菌在海水鱼养殖中的应用前景,研究了饲料中添加活性和热灭活原籍嗜冷杆菌SE6对斜带石斑鱼幼鱼生长性能和血清免疫指标的影响.225尾斜带石斑鱼幼鱼[(14.6±0.2)g]被随机分成3组,每组3个重复.对照组T0投喂基础饲料,实验组T1和T2分别投喂添加1.0×108 cfu/g活性和热灭活嗜冷杆菌SE6的基础饲料,饲喂期为60 d.结果表明,实验前期(0～30 d),实验组T1和T2特定生长率和增重率均显著高于对照组(P＜0.05),饵料系数均低于对照组,但差异不显著(P＞0.05);实验全期(0 ～60 d),实验组T1和T2特定生长率和增重率均显著高于对照组(P＜0.05),实验组饵料系数均下降,其中实验组T1显著低于对照组T0(P ＜0.05).实验30 d时,实验组T1和T2血清IgM和补体C3含量均高于对照组,但差异不显著(P＞0.05);60 d时,实验组T1的补体C3水平、总超氧化物歧化酶活力和IgM含量均显著高于对照组T0(P＜0.05),实验组T2的补体C3水平、T-SOD活力、IgM含量和溶菌酶活力也高于对照组,但差异不显著(P＞0.05).总之,活性和热灭活嗜冷杆菌均可不同程度地促进石斑鱼生长,降低饵料系数,并能提高石斑鱼特异性和非特异性免疫功能.热灭活嗜冷杆菌的应用效果略低于活性菌,但其具有安全性高、质量稳定、生产储藏容易等优势,在海水鱼养殖中的应用值得深入研究.