散鳞镜鲤皮肤囊肿病病原的分离与鉴定

<正>吉陶单极虫隶属于后生动物亚界,粘体动物门,粘孢子纲,双壳目,单极虫科,单极虫属。目前,已报道单极虫属种类约100余种,主要寄生于淡水鱼类,少数种类可寄生于海水鱼类当中。绝大部分种类不会导致鱼类疾病,仅少数几种单极虫会导致鱼类的大量死亡,如寄生于异育银鲫皮肤的“肤孢子病”武汉单极虫、寄生于异育银鲫鳃上的“鳃孢子虫病”汪氏单极虫以及寄生于鲤或散鳞镜鲤肠道或皮肤的吉陶单极虫等。     

寄生部位分化对吉陶单极虫种群分化的影响

为探究寄生部位分化对黏孢子虫种群分化的影响, 以吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)为例, 研究了寄生于鲤(Cyprinus carpio)皮肤和肠道的吉陶单极虫的形态、寄生特征和分子遗传信息。寄生皮肤的吉陶单极虫(S 型)形成单个明显孢囊, 直径约 2.1 cm, 寄生肠道的吉陶单极虫(I 型)形成多个(16 个)孢囊, 直径 0.21~0.82 cm; 孢子形态特征相比, S 型和 I 型孢子鞘膜宽差异不显著(P＞0.05), 但孢子厚差异显著(P＜0.01), 孢子长、极囊长、鞘膜长、孢子宽和极囊宽呈现极显著差异(P＜0.001); 组织病理结果显示, 二者均寄生于结缔组织中, 引起淋巴细胞浸润、组织增生等炎症反应, 但 S 型孢子主要分散在真皮疏松层, 部分孢子侵入致密层, 造成结缔组织弯曲、变形, 而 I 型孢子主要分散在肠黏膜下层上方, 挤压并导致肠绒毛萎缩; 分子序列比对发现, S 型和 I 型的 SSU rDNA 序列相似度较高, 为 99.7%, 具有 4 个差异位点, ITS-5.8S rDNA 序列间相似度较低, 仅 97.3%, 共有 20 个差异位点。基于 SSU rDNA 和 ITS-5.8S rDNA 序列构建的系统进化树显示, S 型和 I 型于吉陶单极虫支系内部各自聚类, 表明相同寄生部位的吉陶单极虫具有更近的亲缘关系。综上所述, 寄生不同部位的吉陶单极虫在形态、寄生特征和遗传信息方面存在不同程度的差异, 具有明显的种群分化特征, 说明寄生部位分化是驱动黏孢子虫种群分化的重要因素。     

吉陶单极虫地理分布新记录及不同地理株系间的比较

为获知吉陶单极虫不同地理株系间的遗传变异及系统发育关系,实验对吉陶单极虫中国重庆、中国湖北、中国四川、日本盐田、韩国全北、韩国首尔等地理株系进行形态学比较及基于18S rDNA序列的变异位点、相似度、遗传距离、基因型的比较和系统发育分析.结果 发现,吉陶单极虫各株系孢子形态特征基本一致;18S rDNA序列相似度为99...     

南美白对虾肝肠胞虫的分离及形态学观察

为了研究江苏地区感染南美白对虾(Penaeus vannamei)的肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的形态学特点,分析与国外报道的差异性,本研究以江苏地区感染肝肠胞虫的南美白对虾肝胰腺组织为研究材料,通过蔗糖密度梯度离心等方法进行肝肠胞虫初步分离纯化,构建一种肝肠胞虫荧光染色检测方法,显微观察肝肠胞虫的孢子形态结构。结果发现感染江苏地区南美白对虾的肝肠胞虫孢子主要分布在35%~40%浓度的蔗糖层面,可推算其密度为1.15~1.17 g/m L。荧光显微镜下可见孢子椭圆或圆形,呈亮蓝色,孢子微小但可计数,显微观察可见肝肠胞虫孢子大小约为1.7μm×0.9μm,外壁上有大量白色瘤状物,疑似胞壁蛋白,孢子表面布满细小褶皱,孢子具有一个细胞核,极丝4~6圈,细胞壁由一相对薄的电子透亮的孢子内壁和电子致密的孢子外壁组成。结论认为江苏地区南美白对虾肝肠胞虫的形态结构与国外报道的吻合,本研究建立的肝肠胞虫分离纯化、荧光染色方法以及取得的肝肠胞虫形态学资料可为其检测和研究提供参考。     

鳃基碘泡虫中国新记录及组织病理

为了鉴定感染鲤鳃的病原并分析其鳃部严重受损的病因,本研究运用形态计量学、分子生物学、系统发育学和组织病理学方法,对其进行了详细研究。结果显示,该致病黏孢子虫寄生于鲤鳃弓,孢子壳面观呈椭圆形或近圆形,缝面观呈柠檬形,顶面观呈橄榄形;孢子长9.2～11.8μm,宽8.3～10.5μm,厚4.4μm;拥有2个大小不等的水滴形极囊,2个极囊前端略微靠拢,大极囊长3.5～4.7μm、宽2.4～3.1μm,小极囊长2.8～3.8μm、宽1.8～2.6μm,大、小极囊极丝分别缠绕5圈和3圈;部分孢子后端可以见"V"形褶皱,但未观察到囊间突起、黏液被膜和嗜碘泡。18S rDNA与已报道的鳃基碘泡虫相似度达99.69%.因此,该寄生虫的形态学与分子生物学数据以及宿主信息表明,该种为鳃基碘泡虫,属中国新记录。孢囊发生在病鲤鳃部传入和传出动脉之间。由于孢囊体积增大,传入和传出动脉受到压迫而变形、堵塞;鳃丝基部也因此发生机械性断裂;部分孢囊周围结缔组织受到破坏。孢囊破裂后,孢子浸润到周围组织。研究表明,鳃基碘泡虫的孢囊压迫主血管,破坏鳃丝,致使鳃丝血流不畅、供血不足,进而导致鳃呼吸功能丧失,是病鲤致死的主要原因。本研究提供的鳃基碘泡虫的形态、分子和病理数据可为水产养殖中鳃基碘泡虫病的防控提供理论依据。     

福建南部养殖石斑鱼匹里虫(Pleistophora sp.)病观察

近年来，福建南部海区一些网箱养殖石斑鱼常见一种流行性孢子虫病，病鱼主要表现为游动失常、厌食、消瘦。外表无明显病理症状，部分病鱼腹部膨大变形，严重者可引起死亡。剖检可见腹腔、生殖腺、肝脏、结缔组织以及肌肉组织内散布或成串排列数个到数十个大小不一的黑色或银灰色孢囊。包囊内含大量孢子虫的子孢子，子孢子呈圆形或椭圆形，大小约4～5μm。根据形态学以及寄生特点确定该寄生虫是一种匹里虫。     

散鳞镜鲤单极虫病的研究

<正> 在湖南省邵阳地区水产研究所饲养亲鲤的池塘中,发现散鳞镜鲤亲鱼被一种单极虫大量侵袭引起发病、死亡,使生产遭受损失,为了探索病原及其病理变化,寻找有效的防治方法,对此病进行了研究。     

州河鲤、建鲤和框鳞镜鲤的mtDNA D-loop的RFLP分析

应用PCR技术扩增了州河鲤、建鲤以及框鳞镜鲤mtDNA的D-loop区段,并用13种限制性内切酶对扩增到的片段进行了分析。结果显示:在3种鱼分别扩增到的约1.6kb的DNA片段上,13种限制性内切酶中有8种(AluⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ、HaeⅢ、HapⅡ、HinfⅠ、TaqⅠ和XspⅠ)有酶切位点,4种(DraⅠ、HaeⅢ、TaqⅠ和XspⅠ)个体间存在变异。不同酶切结果组合后,共得到6种单倍型。州河鲤中以单倍型Ⅲ为主,达91.37%,建鲤以单倍型Ⅵ为主,达81.25%;框鳞镜鲤中单倍型Ⅱ占39.47%,单倍型Ⅲ占47.37%;州河鲤、建鲤以及框鳞镜鲤群体内的单倍型多样性指数(h)和核苷酸多样性指数(π)分别为0.1603、0.3327,0.6287、0.003042,0.004838、0.007163。州河鲤与框鳞镜鲤间的Rogers遗传距最小,为0.4080;州河鲤与建鲤间的为0.8440;框鳞镜鲤与建鲤间的为0.6469。     

异育银鲫武汉单极虫病发生、发展、消退和消失的病理变化与PCR分析

为探究武汉单极虫病疾病过程和病理变化等特点,根据患病异育银鲫体表孢囊内有无成熟孢子和成熟孢子的崩溶解程度,将该病划分为发生、发展、消退和消失4个疾病时期,并分别进行病理变化观察和巢式PCR分析。结果发现,发生期的病鱼体表刚形成的孢囊使鳞片和皮肤微微隆起,孢囊乳白色,孢囊内分布着正在繁育逐渐增多的营养体,尚未出现成熟孢子;发展期的病鱼孢囊内已出现成熟孢子,孢囊逐渐增多增大,其表面黑色素细胞增加而呈灰黑色,感染强度高的病鱼出现死亡或畸形;消退期的成熟孢子通过破裂孢囊流入水体或不同步地崩溶解而减少直至全部溶解,孢囊随之逐渐缩小,使得黑色素细胞更为密集,此时期病鱼病情减轻不再出现死亡现象;消失期的病鱼孢囊平坦,内已无成熟孢子,只残留逐渐减少的成熟孢子崩溶解物质,黑色素细胞逐渐减少,最后原孢囊部位被结缔组织取代。巢式PCR分析结果表明,巢式第一轮和第二轮PCR在4个疾病时期都分别能扩增出1 584和853 bp的武汉单极虫目的条带,但在消失期的后期只有巢式第二轮PCR扩增出853 bp目的条带,说明残留的核酸物质含量逐渐减少,10月下旬后原孢囊部位巢式PCR扩增已无条带出现。本研究不仅揭示了武汉单极虫寄生部位在4个疾病时期的病理变化特点,而且明确了疾病消退和消失的2种方式,孢囊内成熟孢子通过破裂孢囊进入水体的方式和首次发现的孢囊内成熟孢子通过崩溶解的方式。     

辽河鲶肝脏粘孢子虫病治疗效果试验

粘孢子虫（Ｍｙｘｏｓｐｏｒｉｄｉａｎ）属于孢子纲,粘孢子目,其种类繁多分布广,鱼体的各器官组织都可寄生,且每个种类都有特定的寄生部位,粘孢子虫对鱼类的危害也日趋严重。辽宁地区最常见的种类有：鲤单极虫（Ｈｅｌｏｈａｎｅｌｕｓｃｙｐｒｉｎｉ）。鲤碘泡虫（...     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268～+56 bp,且-1 308～-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224～+48 bp,且+48～+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229～-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

中华鲟、史氏鲟及达氏鳇血清免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸氨分步沉淀和Sephadex G200凝胶层析的方法,首次分别纯化制备了健康非免疫状态下中华鲟（Acipenser sinensis）、史氏鲟（Acipenser schrenckii）和达氏鳇（Huso dauricus）的血清免疫球蛋白（Ig） ,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、蛋白免 疫印迹（Western blotting）及免疫琼扩实验等方法对其Ig及Ig亚单位的分子量和部分特性进行了分析。PAGE及SDSPAGE的结果显示：史氏鲟,中华鲟和达氏鳇IgM的相对分子量分别为867 kD, 896 kD和924 kD;3种鲟鱼Ig的重链分子量均为88 kD,都具有29 kD的轻链,其中达氏鳇还另有一分子量约为26 kD的轻链蛋白。分子量的测定及计算结果显示鲟鱼的Ig为四聚体。Western-blotting的检测结果表明,3种鲟鱼Ig的重链与其Ig具有同样的抗原性,在硝酸纤维素膜上可被兔抗鲟Ig多克隆抗体所识别,而轻链的Western blotting检测结果则呈阴性。免疫沉淀反应的结果显示,3种鲟鱼的血清及其Ig与相互之间的兔抗Ig血清有免疫沉淀反应,但与兔抗鲤Ig血清无免疫沉淀反应,这表明3种鲟科鱼类的Ig在结构和序列上是较为相似的,而与鲤鱼等高等硬骨鱼类的Ig存在较大的差别。     

花鲈ncc、nkcc基因在海、淡水适应中鳃组织的表达与定位分析

为探究ncc、nkcc基因在花鲈渗透调节中发挥的作用,实验通过全基因组鉴定、多重序列比对、系统进化树构建以及蛋白结构预测对花鲈ncc进行了鉴定及序列分析,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测ncc和nkcc在海水、淡水花鲈鳃组织中的表达水平,利用原位杂交技术确定ncc2和nkcc1a在海水及淡水花鲈鳃中的表达位置。结果显示,从花鲈中鉴定出2个ncc基因,即ncc1和ncc2,其编码序列(CDS)长度分别为2 691和3 120bp,编码896和1 039个氨基酸,在进化上具有保守性。ncc2在淡水花鲈鳃组织中的表达量显著高于海水,而nkcc1a在海水花鲈鳃组织中的表达量显著高于淡水,ncc1、nkcc1b、nkcc2在海淡水中的表达量则无显著差异。淡水适应过程中花鲈鳃组织中的ncc2的表达量逐渐上调,而nkcc1a的表达量逐渐下调;海水适应过程则呈现相反的表达趋势。此外,原位杂交结果显示,ncc2和nkcc1a基因分别位于淡水与海水中鳃组织的相邻鳃小片间的鳃丝上皮。以上结果表明,ncc2和nkcc1a基因分别编码淡水及海水花鲈鳃中重要的Na⁺及Cl     

浒苔对赤潮异湾藻的克生作用

研究了浒苔对赤潮微藻—— 赤潮异湾藻生长的克生效应。结果表明, 浒苔新鲜组织对赤潮异湾藻的生长具有强烈的克生效应; 一次性添加浒苔培养过滤液对赤潮异湾藻生长没有显著的抑制作用, 而半连续添加浒苔培养过滤液对赤潮异湾藻生长具有显著的克生作用; 浒苔干粉末和甲醇抽提液均对赤潮异湾藻的生长产生显著的抑制作用。试验结果表明, 抑制赤潮异湾藻生长的物质很可能更多地存在于浒苔组织内, 向环境中分泌的克生物质较少。因而, 克生物质的连续分泌是有效克制赤潮异湾藻生长的关键。同时, 克生作用存在着明显的浓度效应, 当抑制物浓度达到一定阈值才表现出明显的克生作用, 在阈值之上浓度越高克生作用越强。     

核糖体DNA在厦门白姑鱼和大黄鱼染色体上的比较定位

为了探究石首鱼核型微观结构上的变化,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)比较定位了厦门白姑鱼和大黄鱼18S rDNA和5S rDNA的分布特征。结果表明,厦门白姑鱼与大黄鱼在宏观核型以及18S rDNA和5S rDNA染色体分布等3个方面均存在较大差异。厦门白姑鱼的核型公式为2n=48t,臂数FN=48;单对18S rDNA信号分布于1号染色体臂间;单对5S rDNA信号分布于3号染色体近着丝粒区域。大黄鱼的核型公式为2n=2sm+4st+42t,臂数FN=50;单对18S rDNA信号分布于18号染色体短臂端部;5S rDNA信号9~11对,除一对分布于臂间外,其余全部分布于着丝粒端或短臂端部。综合其他石首鱼核型数据可以推断:厦门白姑鱼呈现原始核型特征,而大黄鱼核型是原始核型经染色体重排和/或转座衍生的特化核型;石首鱼宏观核型和18S rDNA分布模式总体保守,仅少数物种存在变化,而5S rDNA位点的分布模式存在高度的种间变化。本研究首次揭示了石首鱼物种间核型微观结构的变化,为进一步开展石首鱼分子细胞遗传学研究奠定了基础。     

虾夷扇贝与风向标扇贝种间杂交的初步研究

针对虾夷扇贝在养殖过程中出现的问题,本研究以风向标扇贝和虾夷扇贝为亲本进行了种间杂交实验,培育出了虾夷扇贝（♀）×风向标扇贝（♂）（PY♀×PC♂）及风向标扇贝（♀）×虾夷扇贝（♂）（PC♀×PY♂）两种杂交一代,并对其早期发育及幼虫期和稚贝期生长进行了比较。结果显示,PY♀×PC♂杂交一代的受精率、孵化率和幼虫期的生长和存活率介于双亲之间,而壳高和壳长的生长均高于双亲,表现出显著的杂种优势;PC♀×PY♂杂交一代的受精率、孵化率、幼虫期生长和存活率均低于双亲,表现为杂种劣势。在养殖第1年,PY♀×PC♂杂交一代的壳高、壳长、壳宽和体质量增长率均高于双亲,杂种优势显著。研究表明,卵子来源对后代的表现具有极其显著的影响,以雌性虾夷扇贝与雄性风向标扇贝进行种间杂交从而改良虾夷扇贝种质是可行的。     

大黄蒽醌提取物对罗氏沼虾抗鳗弧菌感染的研究

将罗氏沼虾随机分成5组,每组三个平行,每个平行约1000尾(个体均重1g左右),第1组为对照组,投喂基础日粮,另外4组为试验组,在基础日粮中分别添加0.05%、0.1%、0.2%、0.4%大黄蒽醌提取物,饲养6周后对罗氏沼虾进行鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染.测定生长以及0、12、24、48h血清和肝胰腺溶菌酶、丙二醛(MDA)、总抗氧化能(T-AOC)以及超氧化物歧化酶(SOD)等指标.生长试验表明,与对照组相比,0.1%组、0.4%组罗氏沼虾的增重率、特定生长率显著提高,饵料系数显著降低.攻毒试验Ⅰ表明,各组48h内罗氏沼虾血清溶菌酶活性、肝胰腺溶菌酶含量、血清T-AOC均呈先升高后降低趋势,其中它们的最大值分别出现于0.4%组的12h、0.2%组24h、0.1%组12h;肝胰腺SOD活力呈上升趋势,而血清MDA则一直下降.攻毒试验Ⅱ表明,大黄蒽醌提取物能有效地降低试验组罗氏沼虾的死亡率,提高免疫保护率,其中0.4%组的保护效果为最佳.因此,在饲料中添加大黄蒽醌提取物降低罗氏沼虾对病原的敏感性,增强机体抗病力,促进生长.     

近江蛏精子超微形态结构观察及与缢蛏精子的比较

利用扫描电镜和透射电镜分别观察了近江蛏和缢蛏成熟精子的超微形态结构。发现近江蛏精子与缢蛏精子在超微形态结构上差异很大。近江蛏精子为典型的原生型,成熟精子由头部、中段和尾部组成,头部包括顶体和细胞核。近江蛏精子与缢蛏精子顶体均为保龄球状,但近江蛏精子顶体全长比缢蛏短。近江蛏精子细胞核略扁圆形,外缘具8～9个圆弧形凸起;缢蛏精子细胞核则呈圆球状。近江蛏精子中段由线粒体和中心粒复合体构成,线粒体一般5个,个别4～6个;缢蛏线粒体5个或6个。近江蛏精子尾部为细长的鞭毛,轴丝为“9 2”结构,与缢蛏的相同。从近江蛏与缢蛏的精子形态差异看,两者应属于种间差异。     

抑食金球藻对翡翠贻贝抗氧化酶系统的影响

本研究以单种抑食金球藻及其与亚心形四爿藻的混合藻为实验组,以亚心形四爿藻为对照,探究抑食金球藻对翡翠贻贝超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量的影响。结果显示,抑食金球藻显著影响翡翠贻贝的SOD活性、MDA和GSH含量,各实验组均表现出诱导升高与抑制降低交替出现的规律。单种高、中浓度的抑食金球藻在短期(3 h)内即可对翡翠贻贝的SOD活性产生影响,混合藻组中的SOD活性上升较慢,说明亚心形四爿藻可以延滞氧化还原系统的反应时间。各实验组翡翠贻贝GSH含量在2 d内均显著低于对照组,且混合藻组与单种抑食金球藻组相差不大,提示亚心形四爿藻对抗氧化还原损伤并未起到明显的缓解作用。