双抗体夹心ABC-ELISA检测弓形虫循环抗原方法的建立

为检测弓形虫循环抗原,以实现弓形虫急性感染的早期诊断,本研究建立了基于ABC(avidin biotin-peroxidase complex)放大系统的双抗体夹心ELISA方法。通过制备弓形虫排泄分泌抗原(ESA)并免疫动物,经3种抗原的筛选以获得抗循环抗原(CAg)的单抗,以方阵滴定法确定最佳多抗包被浓度和单抗工作浓度,利用夹心法和ABC放大系统建立检测弓形虫循环抗原的夹心ABC-ELISA方法,用该方法对人工感染犬血清和其他阳性血清样本进行检测以确定该方法的检出时间和准确性,并应用于临床样品的检测。结果:获得了3株针对不同抗原表位的单克隆抗体,并对CAg有较高特异性。双抗体夹心ABC-ELISA反应条件:兔多抗包被浓度为3.7μg/mL,生物素标记3A5、3E5和10F5-3单抗在混合工作液中的浓度分别为0.1、0.13和0.12μg/mL。该ELISA方法对ESA最低检测限为11.9 ng/mL,并与隐孢子虫早期感染牛血清、血吸虫尾蚴早期感染牛血清、艾美耳球虫早期感染鸡血清、犬瘟热急性感染早期血清、犬细小病毒急性感染血清无交叉反应。用该ELISA方法检测人工感染的犬,于感染后2 d血清即显示阳性,该方法能明显区分标准阳性血清和阴性血清。用该方法检测68份猪临床血样(其中包括2份标准阳性血清),检测结果与Nest-PCR结果一致。表明该双抗体夹心ABC-ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于弓形虫急性感染的早期或活动期的诊断。     

应用生物素-亲和素系统检测感染兔弓形虫抗体的实验研究

鉴于弓形虫病感染的多样化,病原诊断又较困难,血清学检测逐渐成为常规辅助诊断方法之一.七十年代末国内外相继建立了检测血清中抗弓形虫抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA).近年来,生物素-亲和素系统(BAS)已用于多种抗原抗体系统但未见检测弓形虫抗体的报道.本文应用亲和素和生物素标记的过氧化物酶复合物(ABC)为标记物的ABC-ELISA方法检测感染兔弓形虫抗体的实验研究并与常规ELISA法进行对比观察,现将初步试验结果报告如后.     

囊虫病特异诊断方法的研究

应用间接ELISA对囊虫粗抗原、B抗原、用等电聚焦技术分离的抗原组分及特异McAb亲和层析抗原的特异性作了评价,结果均不理想。用McAb分析查明,在某些囊虫抗原分子上既有特异性抗原决定簇,又有非特异性决定簇。应用特异McAb以R-PIⅡ和Ⅰ-ELISA检测囊虫病人和猪的血清抗体,结果完全消除了假阳性反应;用R-PIⅡ微量法和Ⅰ-ELISA检测,病人血清的阳性率为87.36%(76/87)和89.66%(78/87),病猪血清的阳性率为89.32%(92/103)和86.41%(89/103);用R-PHI玻片法检测,病猪血清的阳性率为87.32%(90/103)。     

单克隆抗体与寄生虫疫苗

单克隆抗体(McAb)具有众多优点使之用于动物寄生虫病的免疫学诊断、免疫治疗及其疫苗的研制。首先,用McAb筛选某种动物寄生虫的抗原,再以McAb和这种特异性抗原建立直接(检测寄生虫抗原)和间接(检测抗寄生虫抗体)的免疫学诊断方法。其次,McAb作为免疫保护的试剂。McAb所以在一定程度上预防寄生虫的感染与再感染。     

猪瘟单克隆抗体的制备及ACI-ELISA检测猪瘟病毒的研究

本研究用猪瘟石门毒(CSFV-Shimen)免疫BALB/C小鼠,按常规单克隆抗体(McAb)技术方法制作,最终获得4株McAb,分别命名为AC9、CF8、DG5和EC9,4株McAb与基因工程CSFV E2蛋白反应结果表明:AC9、CF8和EC9是抗CS-FV E2蛋白的McAb.用AC9和CF8McAb对CSFV进行抗原捕获间接ELJSA试验(ACI-ELISA),通过一元McAb和二元McAb CAI-ELISA试验的比较,结果表明AC9与CF8两种McAb有协同作用,其捕获CSFV的能力比一元McAb显著提高.方阵试验结果表明:McAb和血清多抗(PcAb)的最佳工作稀释度分别为1:400和1:200.特异性试验和敏感性试验结果显示本法特异性强,敏感性高.最后用ACI-ELISA与PCR对30份病料的检测结果比较,表明ACI-ELISA与PCR检测结果相符.上述结果说明本研究所获得AC9和CF8可用作猪瘟诊断试剂盒的研制,是检测CSFV的有效方法.     

单克隆抗体应用于ELISA诊断猪弓形虫病的研究

本文应用抗弓形虫单克隆抗体ELISA对猪弓形虫病感染进行现场调查研究。用一般ELISA的间接法、双单抗夹心法、单抗及第二抗体夹心法分别检测Ab、Cag及CIC。杭州地区一般屠宰猪血清阳性检出率分别为52.79%、0%及8.22%;有弓形虫病流行史的某种猪场母猪血清的阳性检出率分别达84.51%、32.65%及68.39%,三者均明显高于屠宰猪。14头疑似弓形虫病猪血清的阳性检出率分别为6/14、10/14及12/14,Cag或和CIC阳性率合计为14/14。初步认为应用ELISA间接法检测Ab可作为猪弓形虫感染血清流行病学检查;应用McAb ELISA夹心法检测CAg及CIC具有早期诊断猪弓形虫病的价值,并可作为历史流行点猪弓形虫病是否存在近期流行或尚有活动性感染及暴发性流行的监测方法。     

羊弓形虫病间接ELISA诊断方法的建立

为比较5种弓形虫抗原的诊断效果,建立实用的羊弓形虫病诊断方法,本研究制备了弓形虫速殖子全虫抗原和4个重组蛋白(GRA1、MIC3、MAG、BAG1),正交试验比较其免疫反应性,从中筛选出相对优势抗原并建立羊弓形虫病间接ELISA(iELISA)诊断方法,用于检测弓形虫特异的IgG抗体。研究结果表明：除BAG1外上述4种抗原均具有较好的免疫反应性,综合考虑选择致密颗粒蛋白1(GRA1)作为诊断抗原建立了GRA1-iELISA,其检测弓形虫抗体灵敏度大于1∶100(血清稀释度),且不与羊莫氏巴贝斯虫、吕氏泰勒虫、捻转血毛线虫阳性血清发生交叉反应,特异性良好;运用建立的方法和改良凝集试验分别对采自山羊屠宰场的80份血清样品进行检测,测得的弓形虫感染阳性率分别为28.75%(23/80)和31.25%(25/80),二者总符合率为82.5%。本研究建立的ELISA检测方法对羊弓形虫病的诊断以及商业化试剂盒的开发具有重要参考价值。     

相思子毒素-a单克隆抗体的制备与鉴定

用含1%甲醛的磷酸盐缓冲液对相思子毒素-a(abrin-a)减毒处理制备类毒素,以类毒素为免疫抗原分4次免疫3只BALB/c小鼠。采用聚乙二醇(PEG)法,取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选分泌抗abrin-a的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株。将阳性细胞株接种BALB/c小鼠制备McAb腹水,根据亚类鉴定结果,分别采用蛋白A或蛋白G亲和层析柱纯化腹水,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测McAb特异性,Western-blot法分析McAb抗原识别位点。结果获得1G5、3C2和4G1共3株McAb杂交瘤细胞株,均为抗abrin-a的特异性McAb,与相思子凝集素、蓖麻毒素(ricin)和蓖麻凝集素均无交叉反应,其中4G1为特异性结合abrin-a A链的McAb,1G5和3C2两株为特异性结合abrin-a B链的McAb;制备的McAb可用于abrin-a含量的检测。     

应用单克隆抗体-ELISA检测弓形体循环抗原及免疫复合物的有关因素

本文对 McAb-ELISA 检测弓形体 CAg 及 CIC 的有关因素进行了研究.结果表明:(1)用 McAb 包被液致敏反应板的效果,碳酸盐缓冲液(pH9.6)优于磷酸盐缓冲液(pH7.4).(2)纯化的 McAb 及 McAb-HRP 冷藏贮存,一年内对 FLISA 的检测效果无影响.但 McAb 致敏的反应板只能冷藏一个月.(3)McAb 致敏反应板时,置37℃温育2小时的检测效果似较冰箱过夜为优.(4)普通血清、灭活血清及滤纸血的 ELISA 结果,均无明显差别.(5)检测 CAg 的血清及酶结合的孵育方法可采用 ELISA一步法,而检测 CIC 则必须采用常规二步法.     

相思子毒素-α单克隆抗体的制备与鉴定

用含1%甲醛的磷酸盐缓冲液对相思子毒素-a(abrin-a)减毒处理制备类毒素,以类毒素为免疫抗原分4次免疫3只BALB/c小鼠.采用聚乙二醇(PEG)法,取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选分泌抗abrin-a的单克隆抗体(MeAb)杂交瘤细胞株.将阳性细胞株接种BAI.B/c小鼠制备McAb腹水,根据亚类鉴定结果,分别采用蛋白A或蛋白G亲和层析柱纯化腹水,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测McAb特异性,Western-blot法分析McAb抗原识别位点.结果获得1G5、3C2和4G1共3株McAb杂交瘤细胞株,均为抗abrin-a的特异性McAb,与相思子凝集素、蓖麻毒素(ricin)和蓖麻凝集素均无交叉反应,其中4G1为特异性结合abrin-a A链的MCAb,1G5和3C2两株为特异性结合abrin-a B链的MCAb;制备的MCAb可用于abrin-a含量的检测.     

绵羊肺腺瘤病毒衣壳蛋白杂交瘤细胞系的建立

为了制备特异性的抗绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV) 内蒙株衣壳蛋白(CA)的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞系,以原核表达CA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经杂交瘤技术进行融合,同时以表达蛋白作为包被抗原进行特异性ELISA检测,共筛选到6株阳性杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆后,最终得到了5株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株;再利用CA真核表达蛋白以间接免疫荧光法,对此5株杂交瘤细胞进行进一步的特异性鉴定。结果显示,有3株具有特异性强荧光反应,也能检测到目的基因的表达产物。本试验获得了3株稳定分泌抗JSRV-NM株CA蛋白McAb的杂交瘤细胞系,为建立检测病原的特异性诊断方法、分析JSRV-NM株CA蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位等奠定基础。     

测定传染性法氏囊病抗体的三种方法比较

目前检测传染性法氏囊病(IBD)免疫水平的方法主要是琼脂扩散试验(AGP)和中和试验(VN)。但前者的敏感性低,且因抗原浓度的差异使抗体难以定量;后者虽有较高的敏感性,但耗时费工,不易推广。为此,作者利用抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)的特异性单克隆抗体(McAb)建立了夹心阻断ELISA,用以检查血清抗体,     

ELISA和IHA检测弓形虫抗体的比较试验研究

目的:分析ELISA方法和IHA方法检测弓形虫病的可靠性。方法:本文应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接血凝试验(IHA)两种方法,平行检测来自龙岩市某个猪场的32份猪血清中的抗弓形虫特异性抗体。结果:ELISA和IHA对猪弓形虫抗体阳性检出率分别为62.5%(20/32)、53.13%(17/32),这两种方法的阳性检出符合率较高,为71.88%(23/32)。其中,ELISA方法的敏感性(93.33%)、检测效率(81.25%)以及Youden指数(63.92%)都在IHA方法之上,但ELISA方法的特异性(12/17,70.59%)略低于I-HA方法(13/17,76.47%)。结论:ELISA和IHA两种方法均可用于猪弓形虫病的诊断和血清学调查,但ELISA方法更适用于猪弓形虫病的血清学调查。     

免疫酶技术在弓形虫病诊断和流行病学调查中的应用

近年来,免疫酶技术以其高度的特异性和敏感性,在弓形虫病诊断和流行病学调查中得到了广泛应用,从而推动了弓形虫病的防治研究进入了一个新阶段。本文就几种常用的免疫酶方法在弓形虫病的应用概述如下: 一、酶联免疫吸附试验(ELISA) 1971年Engvall和Van Weeman等首次创立ELISA技术。其基本原理就是用酶催化底物反应的生物放大作用,提高抗原抗体免疫学反应的检测敏感性。Volley等首先将ELISA用于检测弓形虫病患     

弓形虫病诊断方法研究进展

本文介绍了几种弓形虫诊断方法,包括染色试验、间接血凝试验、改良凝集试验、间接免疫荧光抗体染色试验、酶联免疫吸附试验、免疫胶体金技术和干扰素释放反应。在使用活的、有毒力的速殖子情况下,染色试验(DT)仍然是特异性、敏感性和重复性良好的弓形虫病检测手段;间接血凝试验(IHA)特异性不高,但由于其具有简便快速的特点,经常应用于流行病学调查;改良凝集试验(MAT)也可以用于流行病学调查,且因其特异和敏感性高,目前仍然是检测弓形虫病的金标准;亲和力ELISA省时省力,对于鉴定弓形虫急慢性感染有较高的应用价值;免疫胶体金技术(GICT)适用于弓形虫病早期检测和诊断,适合在基层推广应用;干扰素释放反应(IGRA)目前主要应用于人的弓形虫检验,在动物的检测中有待进一步发展。     

应用ABC-ELISA检测牛白血病病毒抗体的研究

应用ABC-ELISA检测牛血清中的BLV抗体,并同常规ELISA和AGID试验作比较。结果,ABC-ELISA的显色反应强,且非特异性反应低,比常规法灵敏8倍,比AGID试验灵敏400倍。是一种高度敏感的免疫学检测法。     

ELISA和LAT检测猪血清弓形虫抗体的比较

应用弓形虫重组蛋白rMIC3为抗原建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)和乳胶凝集试验(LAT)2种方法,平行检测来自36个猪场的471份猪血清中的抗弓形虫特异性抗体。结果显示,ELISA和LAT对母猪弓形虫抗体的阳性检出率分别为42.86%(21/49)和44.90%(22/49),2种方法的阳性检出符合率为95.45%(21/22);对育肥猪的阳性检出率分别为42.06%(135/321)和43.61%(140/321),2种方法的阳性检出符合率为93.57%(131/140);对仔猪的阳性检出率分别为29.07%(30/101)和45.54%(46/101),2种方法的阳性检出符合率为63.04%(29/46)。结果表明,ELISA和LAT可用于猪弓形虫病的诊断和血清学调查,LAT更适合于仔猪弓形虫病的检测。     

新孢子虫和弓形虫ELISA及western blot检测方法的建立及应用

为建立牛新孢子虫和弓形虫的免疫学检测方法,并调查新疆部分地区牛新孢子虫和弓形虫的感染情况,本研究应用纯化的新孢子虫重组蛋白SRS2(NcSRS2)和弓形虫重组蛋白SAG2(TgSAG2)作为包被抗原,分别建立新孢子虫和弓形虫的ELISA和western blot血清学检测方法,并进行特异性和重复性试验,以其检测662份疑似样品,并与商品化试剂盒检测结果比较验证。特异性和重复性试验结果表明,建立的方法特异性强、重复性良好。采用建立的两种ELISA方法对662份临床样品的检测结果表明,新孢子虫和弓形虫的抗体阳性率分别为13.44%(89/662)和5.29%(35/662);与IDEXX试剂盒和永辉试剂盒的符合率分别为94.11%和95.92%。此外,western blot检测的新孢子虫和弓形虫抗体阳性率分别为5.14%(34/662)和3.17%(21/662);与建立的ELISA检测方法的符合率分别为91.69%和97.89%。本研究为分析奶牛流产的原因提供了一定的依据。     

两种奶牛结核病检测方法的比较

本研究中采用常规皮内变态反应(TST)对广西南宁、柳州共计2 818头黑白花奶牛进行牛结核病检测,采用抗原特异性IFN-γ试验方法对PPD检测结果为阳性、可疑的牛以及部分阴性牛进行复检。将抗原特异性IFN-γ试验与TST检测结果相比,其敏感性为53.33%,特异性为70.49%,符合率为67.11%。本研究证实单独使用PPD皮内变态反应方法在牛结核病的诊断方面存在非特异性强等缺点,易造成假阳性牛的误杀;用抗原特异性IFN-γ试验对TST试验阳性和可疑牛进行复检可以提高特异性,该方法在临床上有重要应用价值。     

施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的表达及单克隆抗体制备

为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳(N)蛋白,并制备其单抗(McAb),本研究在SBV-N基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签后,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac~(TM)1中,构建重组供体质粒pFastBac-His-SBV-N。将pFastBac-His-SBV-N转化DH10Bac E.coli,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-His-SBV-N。将rBacmid-His-SBV-N转染Sf9昆虫细胞制备表达His-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒,借助Ni-NTA琼脂糖纯化重组杆状病毒感染Sf9细胞中的His-SBV-N蛋白。以纯化的HisSBV-N免疫BALB/c小鼠制备McAb,利用ELISA叠加试验检测McAb抗原识别位点的异同,并采用高碘酸钠法对识别不同抗原表位的McAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。最终获得了4株识别不同抗原表位的McAb(2A11、2E1、4H11和6E12)并进行了HRP标记;亚型鉴定表明,2A11为IgG1亚型,2E1、4H11和6E12均为IgG2b亚型;间接免疫荧光试验证实,4株McAb均能够识别稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系;Western blot进一步表明,HRP标记的4株McAb均与His-SBV-N蛋白发生特异性反应。His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。