蕨麻猪生长激素基因的克隆及多态性分析

[目的]探索蕨麻猪生长激素基因与其生理学和生物学特性的关系。[方法]从蕨麻猪血液细胞中提取基因组DNA,通过PCR技术扩增出蕨麻猪生长激素基因序列,进行碱基组成多态性和突变分析。[结果]蕨麻猪生长激素（pGH）基因序列全长1671bp,有5个外显子和4个内含子。外显子1、2、3、4和5的碱基数依次是10、161、117、162和201bp,内含子1、2、3和4的碱基数分别是244、210、192和277bp。除第1外显子和第1内含子碱基剪切有明显的例外,其余全部符合GT-AG规则;蕨麻猪生长激素基因4种碱基含量依次为G〉C〉T〉A。（G＋C）含量和（A＋T）含量分别在62%和37%以上。蕨麻猪编码区第4外显子在＋1046位处A→G,为错义突变,其余均为同义突变。蕨麻猪生长激素基因编码的前体蛋白含216个氨基酸,成熟蛋白是由190个氨基酸残基组成的一个分泌性蛋白;二级结构中含有6个α螺旋结构,三级结构是结构松散的球状蛋白,含有6个α螺旋前区。[结论]为蕨麻猪生长激素基因序列的研究提供了参考依据和借鉴。     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

紫苏PfPDAT基因单核苷酸多态性分析

[目的]磷脂:二酰甘油脂酰转移酶(PDAT)是植物油脂合成最后一步酰基化反应的关键酶之一,研究紫苏PfPDAT基因单核苷酸多态性,旨在分析该基因多态性与紫苏种子油脂含量之间的关系。[方法]以脂肪酸含量不同的7个紫苏品种为试材,通过直接测序法分析PfPDAT基因cDNA全长序列的单核苷酸多态性及其与油脂含量的关系。[结果]在所测总长度为14 679bp的核苷酸序列中,共检测到9个SNP和2个InDel,单核苷酸多态性频率分别为1/1 631bp和1/7 340bp,其中编码区含2个SNP,非编码区为7个。编码区和非编码区发生SNP的频率分别为1/5 439bp和1/543bp。根据PfPDAT基因序列多态性将供试紫苏材料分为不同的单倍型,单倍型H1和H2中都包含有油脂含量较高和含量较低的材料。[结论]PfPDAT基因的单倍型分类与紫苏油脂含量之间没有显著相关性,同时也反映了植物种子油脂合成的复杂性。     

唐鱼生长激素基因的克隆及序列分析

[目的]为开展唐鱼转自源基因研究提供基本构架。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离唐鱼生长激素基因(GH)全长cD-NA序列,同时利用PCR克隆了唐鱼生长激素基因的基因组(gDNA)序列。[结果]序列分析表明:唐鱼GH cDNA的5非编码区为64bp,3非编码区为448 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,共编码210个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。应用MEGA 3.1软件进行序列同源性比较分析的结果显示,唐鱼GH cDNA所编码的氨基酸序列与近缘鱼种(草鱼、青鱼、鳙鱼、鲤鱼、斑马鱼等)的生长激素氨基酸序列有很高的同源性,其中与草鱼和鳙鱼的同源性高达98%。该研究获得的唐鱼生长激素基因的gDNA序列共有1403 bp,包括4个外显子和3个内含子,外显子大小分别150、117、162、204 bp;3个内含子都以GT开头、AG结尾,符合GT-AG法则。[结论]该研究为下一步构建自源GH基因构件,进行唐鱼的转自源GH基因研究,培育出生长快、体型大的唐鱼新品系奠定了基础。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。     

猪生长激素基因(cDNA)的分子克隆

采用 Watson 方法由猪垂体总 mRNA 反转录合成了总 cDNA,合成产率约为12.6%。将总 cDNA 克隆到质粒 pUC19中后,转化大肠杆菌 JM107得到约2500个重组子克隆。用猪生长激素探针进行菌落原位杂交筛选得到2个阳性克隆。对这两个克隆进行多种酶切分析的结果表明,其中质粒 pWH101插入片段长度为830bp 左右,带有全长猪生长激素基因及部分5′端和3′端非编码区。用 Sanger 法分析了此基因5′端203个 bp 的序列,结果除确证己克隆了猪生长激素基因(cDNA)外,还查明了此基因5′端非编码区46bp 的序列。     

湖羊和巴什拜羊BMP15基因c.-1760C>A变异与启动子区活性的关系

[目的]为了解湖羊和巴什拜羊骨形态发生蛋白15(BMP15)基因编码区和5'调控区(5'UTR)序列特征与差异,检测其SNPs(single nucleotide polymorphisms)并探索其功能。[方法]利用克隆测序技术获得湖羊和巴什拜羊BMP15基因编码区和5'UTR序列,运用生物信息学方法分析其序列特征;采用DNA池测序法筛选湖羊和巴什拜羊BMP15基因SNPs,直接测序法检测SNPs位点多态性;采用荧光素酶报告基因系统检测启动子区活性。[结果]湖羊和巴什拜羊BMP15基因编码区序列长度均为1 182 bp,编码393个氨基酸,编码蛋白含有典型的TGF-β结构域;湖羊和巴什拜羊BMP15基因编码区序列的同源性为99.92%,发现1个SNP位点。获得1 806 bp湖羊和巴什拜羊BMP15基因5'调控区序列,发现5个SNPs位点。BMP15基因c.-1760CA位点多态性分析发现湖羊群体中均为CC基因型,巴什拜羊群体中有CC、CA和AA 3种基因型,等位基因C和A频率分别为0.798 1和0.201 9。启动子区活性检测显示CC型启动子区活性明显高于AA型。[结论]湖羊和巴什拜羊BMP15基因编码区序列高度保守,c.-1760CA变异可能影响BMP15基因启动子区活性。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5＇非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1 b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPaseRABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明,T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5′非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPase RABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

宁夏六盘山区黄牛杂交改良群体GHR基因多态性分析

[目的]对宁夏六盘山区黄牛杂交改良群体生长激素受体（GHR）基因的多态性进行分析,为宁夏黄牛杂交改良选育提供理论参考。[方法]采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）对该群体70个个体的GHR基因多态性进行检测。[结果]扩增出了338 bp的目的片段,PCR产物被限制性内切酶AluI消化后表现出多态性,其中AA基因型频率为75.71%;BB基因型频率为24.29%。[结论]共检测到AA和BB 2种基因型,六盘山区黄牛杂交改良群体GHR基因具有多态性。     

抑制素α亚基基因5'UTR区在苏淮猪中的多态性分析

[目的]探究抑制素α亚基基因(INHA)5'UTR区多态性与苏淮猪产仔数相关性,为苏淮猪的分子选育工作提供理论依据。[方法]选取189头健康苏淮母猪,通过PCR扩增和测序对INHA基因5'UTR区基因多态性进行了检测,同时利用生物信息学方法分析该序列特征,最后通过群体遗传学和生物信息学分析了不同基因型对苏淮猪产仔数的影响。[结果]在苏淮猪INHA基因5'UTR调控区-42GA处发现一个SNP位点,对其进行多态性分析,存在3种基因型,分别为GG、GA、AA,且基因型分布不符合哈代温伯格定律(P0.01)。G等位基因为优势等位基因,GG型为优势基因型,GG型苏淮猪的平均总产仔数比AA型多0.63头(P0.05)。[结论]INHA基因5'UTR区多态性可用于苏淮猪繁殖性状的分子标记辅助选择,加速育种进程。     

猪12号染色体几个微卫星标记与部分生产性状的关系研究

众多的微卫星位点及其丰富的多态性是微卫星在各领域广泛应用的基础。在定位ＱＴＬ方面 ,现在通过建立猪资源家系 ,人们已把一些与繁殖、生长、胴体和肉质等方面有关的数量性状位点定位在某些微卫星附近。例如 ,3号染色体上微卫星ＳＷ2 4 2 7-ＳＷ2 51区域与猪的日增重、4号染色体上Ｓ0 1 0 1 -Ｓ0 1 0 7区域与背膘、腹脂、7号染色体上Ｓ0 0 64-Ｓ0 0 66区域与胴体组成和初生重有着很大的关联[1] 。 1 2号染色体为最短的中部着丝粒染色体 ,因与猪生产性状紧密相关的生长激素 (ＧＨ)基因位于其上而倍受重视[2 ,3] 。虽然目前对ＧＨ基因研究得…     

宁夏六盘山区黄牛杂交改良群体GHR基因多态性分析（摘要）

[目的]对宁夏六盘山区黄牛杂交改良群体生长激素受体（GHR）基因的多态性进行分析,为宁夏黄牛杂交改良选育提供理论参考。[方法]采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）,对该群体70个个体的GHR基因多态性进行检测。[结果]扩增出338bp的目的片段,PCR产物被限制性内切酶AluI消化后表现出多态性,其中AA基因型频率为75.71%;BB基因型频率为24.29%。[结论]共检测到AA和BB2种基因型,六盘山区黄牛杂交改良群体GHR基因具有多态性。     

猪H-FABP基因内含子3多态片段的序列分析

[目的]为确定影响肌内脂肪（IMF）沉积的主效基因奠定理论基础。[方法]以马身猪、大白猪、长白猪、杜洛克猪和山西白猪5个品种共383头猪为试验动物,应用PCR-SSCP方法分析猪H-FABP基因内含子3部分片段的多态性,并对每个多态片段进行测序分析。[结果]在猪H-FABP基因内含子3的346位上具有2个等位基因A和B,该位点的变异由碱基A→G的替换造成。[结论]在猪H-FABP基因内含子3发现1个多态位点,为进一步研究H-FABP基因与IMF含量的关系奠定了基础。     

梅花鹿GHR基因完整编码区序列生物信息学分析

为了研究梅花鹿生长激素受体基因的结构和功能,从GenBank中下载梅花鹿、牛、山羊、猪、北极狐、大熊猫、人、猕猴、小鼠、大鼠、鸡、家鹅、绿头野鸭及金鱼的生长激素受体基因完整编码区及氨基酸序列,对梅花鹿与其他13个物种生长激素受体基因的完整编码区及其编码氨基酸序列进行相似性比对,并基于氨基酸序列构建系统进化树,利用BioEdit 7.0等软件对梅花鹿生长激素受体基因的碱基组成及其编码蛋白的理化性质和结构特征进行生物信息学分析。结果表明,梅花鹿与山羊、牛的生长激素受体基因氨基酸序列相似性较高,亲缘关系最近;梅花鹿生长激素受体基因完整编码区长度为1 905bp,编码634个氨基酸,A+T含量高于G+C;其编码的蛋白是一种分子质量为70.927 8ku、等电点为4.56的疏水性不稳定酸性蛋白;该蛋白含有1个信号肽,属于一种分泌型蛋白;存在1个强跨膜区、36个广泛磷酸化位点,二级结构元件以无规则卷曲为主。研究结果可为梅花鹿生长激素受体基因的进一步分析提供详细的生物信息学基础资料。     

猪生长及胴体性状3个相关基因座遗传效应

 【目的】研究猪生长性状相关基因多态性,各多态位点对猪生长及胴体性状的影响,为分子标记辅助选择提供依据。【方法】采用PCR-RFLP方法分析PIT1、HDAC1、IGF2 基因在不同品种酶切位点多态性,分析不同基因型对生长与胴体性状的遗传效应。【结果】PIT1基因C等位基因、HDAC1基因G等位基因、IGF2基因A等位基因均有显著提高生长的效应,达100 kg活重所需时间一般可缩短6～9 d。PIT1基因C等位基因、HDAC1基因G等位基因、IGF2基因A等位基因提高瘦肉率3～5个百分点、背膘厚降低2～3 mm,生长性能指数得到相应提高。【结论】上述基因的有利等位基因有可能在选种中作为分子标记。     

猪繁殖候选基因ERK2的克隆、表达及基因多态分析

 【目的】ERK2基因在细胞增殖和分化调控以及启动卵巢排卵的分子信号等过程中发挥重要作用,是影响猪繁殖性状的重要候选基因。本试验对猪ERK2基因序列、基因结构、基因多态性及其表达规律进行初步研究。【方法】以大白猪为材料,采用RT-PCR方法克隆了猪ERK2基因,Real-Time PCR测定该基因在猪各组织器官中的分布,并对该基因的结构和多态性进行分析。【结果】从猪卵巢组织中克隆获得ERK2基因部分cDNA序列,长1 888 bp,包括一个1 080 bp的开放阅读框,编码359个氨基酸与预测的猪ERK2基因、已报道的人和小鼠等的ERK2基因高度相似;猪ERK2基因在各组织中表达广泛,其中脾脏是表达量最高的组织,在脂肪组织、前后腿肌中基本不表达;猪ERK2基因定位于14号染色体,全长在22 kb以上,包含9个外显子和8个内含子;对第2—9外显子及内含子外显子交界处的内含子序列进行序列突变检测,共检测到11个SNPs和1个插入缺失突变,但绝大部分的变异都是在内含子区域,仅有1个SNP发生于3′UTR区域。【结论】猪ERK2基因cDNA为1 888 bp,编码359个氨基酸残基;在猪各组织中广泛分布,以脾脏的表达量最高;该基因由9个外显子和8个内含子组成,基因保守性较高,共检测到11个SNP和1个插入缺失突变均不在编码区中。     

Sus scrofa interferon epsilon-1基因的克隆与序列分析

[目的]克隆分析Sus scrofa interferon epsilon-1基因,以期为其生物学功能研究奠定基础。[方法]利用Homo sapiens interferon epsi-lon 1(IFNE1)序列(NM_176891.3)对猪HTG库进行搜索,通过对获得的2个片断(CU074336、AC127471)的序列分析,在5'-UTR和3'-UTR设计1对克隆引物,对7日龄仔猪的胃组织进行RT-PCR,将PCR产物克隆、测序,并进行相关分析。[结果]同源性分析结果表明,猪SIFNE1与人、小鼠interferon epsilon-1基因cDNA编码区(CDS)的同源性分别为83.6%和69.2%;蛋白序列同源性分别为76.2%和55.2%。推测其氨基酸序列信号肽为第1～21位氨基酸,IFabd结构域为第59～176位氨基酸,结构特征与人、小鼠的interferon epsi-lon-1相一致。[结论]该研究克隆了Sus scrofa interferon epsilon-1基因,为进一步研究SIFNE1基因的生物学功能奠定了基础。     

牦牛生长激素基因分子特性分析

设计特异性引物,利用RT-PCR方法从牦牛脑垂体中扩增出生长激素基因(YGH)编码区全序列,并进行分子特性分析.结果表明:牦牛生长激素基因编码区全长654 bp,包含一个完整的阅读框,编码217个氨基酸.采用生物信息学方法对分子特性进行分析表明:动物生长激素基因在进化上非常保守,牦牛生长激素基因氨基酸序列与黄牛、山羊、绵羊、马、猪、猫和犬的同源性分别为100%、99.1%、98.6%、88.9%8、8.5%、88.9%和89.4%.牦牛生长激素蛋白有2个明显的疏水区域,存在2个强跨膜区和信号肽,是一种分泌型蛋白质,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,三级结构包含第28-215位氨基酸残基;牦牛生长激素蛋白有较高的抗原指数和抗原表位,这与YGH编码蛋白具有良好的抗原性相一致.     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

[目的]克隆五指山小型猪生长激素释放激素（GHRH）受体基因的cDNA,并对其进行序列分析。[方法]以五指山小型猪耳组织提取的基因纽RNA为模板,根据已报道的猪GHRHRcDNA序列设计3对引物,用RT—PCR方法进行cDNA扩增。PCR产物经回收纯化后,与pMD18-T连接并转化大肠杆菌DH5a,转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆,阳性克隆经LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了五指山小型猪GHRH受体基因的cDNA,该片段长1577bp,编码423个氨基酸。BLAST分析结果表明,该片段与猪GHRH受体基因仅有23个碱基的差异,同源性为98％;而两者GHRH受体基因均由423个氨基酸组成,序列同源性为96％。[结论]该研究为进一步揭示五指山小型猪的矮小机理提供了理论依据。