拟南芥开花抑制因子TFL1与GRFs蛋白的相互作用

【目的】研究拟南芥开花抑制因子TFL1与2个GRFs家族成员GRF4和GRF7之间的互作关系,为进一步解析TFL1抑制植物开花的分子机制奠定基础。【方法】以拟南芥cDNA作为模板,利用基因特异性引物,克隆TFL1、GRF4和GRF7,分别连接入门载体pCR8,经菌落PCR扩增和测序鉴定分别获得这3个基因的入门载体TFL1-pCR8、GRF4-pCR8和GRF7-pCR8。利用LR重组的方法将上述3个入门载体分别与目标载体pGADT7和pGBKT7重组获得酵母双杂交试验载体TFL1-BD、GRF4-AD和GRF7-AD。将TFL1-BD载体分别与GRF4-AD或GRF7-AD载体共同转化酵母感受态细胞,于双缺(-Leu/-Trp)培养基上30℃培养2—3d直至长出酵母克隆,选取合适大小的酵母菌落转移到双缺(-Leu/-Trp)和四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade)缺陷培养基上,通过观察酵母菌落的生长情况判断TFL1与GRFs之间的互作关系。利用LR重组的方法将上述3个入门载体分别与目标载体px-nYFP和px-cYFP重组获得TFL1-nYFP、TFL1-cYFP、GRFs-nYFP、GRFs-cYFP双分子荧光互补试验载体,并分别转化农杆菌感受态细胞。将转化TFL1-nYFP或TFL1-cYFP载体的农杆菌分别与转化GRFs-nYFP或GRFs-cYFP载体的农杆菌共注射烟草叶片,培养48h后在荧光共聚焦显微镜下观察烟草细胞中YFP荧光的表达情况。通过YFP荧光信号的有无来判断TFL1与GRFs之间的互作关系。【结果】成功克隆到拟南芥中的3个基因,分别是534bp的TFL1、888bp的GRF4和798bp的GRF7,并分别获得其入门载体(TFL1-pCR8、GRF4-pCR8和GRF7-pCR8)、酵母双杂交试验载体(TFL1-BD、GRF4-AD和GRF7-AD)和双分子荧光互补试验载体(TFL1-nYFP、TFL1-cYFP、GRFs-nYFP和GRFs-cYFP)。在酵母双杂交试验中,相较于阴性对照组,共同转化TFL1-BD与GRFs载体的酵母菌落在双缺(-Leu/-Trp)和四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade)培养基上都生长较好,结果表明TFL1与GRF4、GRF7在酵母中直接相互作用。在双分子荧光互补试验中,相较于阴性对照组,将转化TFL1-cYFP载体的农杆菌与转化GRFs-nYFP载体的农杆菌共注射烟草细胞之后均在烟草细胞核内产生较强的YFP荧光信号;与此同时,将转化TFL1-nYFP载体的农杆菌与转化GRFs-cYFP载体的农杆菌共注射烟草细胞之后同样在烟草细胞核内产生较强的YFP荧光信号。结果表明,TFL1与GRF4、GRF7在烟草中直接相互作用。【结论】拟南芥开花抑制因子TFL1与GRFs家族的2个成员GRF4和GRF7均直接相互作用。     

烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用

[目的]获得高产量的烟草叶片原生质体.[方法]在前人的基础上,在酶浓度和酶解时间上,对简易大量制备本氏烟叶原生质体的条件进行了进一步的探索;并以此为基础,通过双分子荧光互补试验进一步研究了其在蛋白互作研究中的应用.[结果]在纤维素酶浓度为1.3％,离析酶浓度为0.4％,果胶酶浓度为0.3％,酶解4h,酶解温度28℃,并在简易纯化的条件下制备原生质体,所得到的完整原生质体产量最高,并且细胞碎片和杂质均最少.[结论]该方法为瞬时表达于本氏烟叶中的荧光蛋白研究提供了重要的技术参考.     

红肉苹果MdMKK9互作蛋白的筛选与鉴定

MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一,是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶。为深入研究苹果MKK9的相关功能,以红肉苹果‘黛红’为材料,克隆到MdMKK9基因CDS序列,利用酵母双杂交试验筛选苹果cDNA文库,并通过酵母双杂交筛选、体内双分子荧光互补(BiFC)和体外Pull-down试验进行MdMKK9互作蛋白验证。结果表明,通过对苹果cDNA文库的筛选,共获得11个参与调控植物生长发育及应答逆境胁迫的候选互作蛋白;选取花青苷合成相关蛋白MdCHS及氮胁迫调控相关蛋白MdSPX3进行酵母双杂交、体内BiFC及体外Pull-down试验,结果证明MdMKK9可与MdSPX3互作。     

双分子荧光互补技术（BiFC）分析玉米 MAPK5与 bZIP72蛋白的相互作用

[目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5与Zmb ZIP72的Bi FC融合载体同时轰击洋葱表皮细胞,细胞核中能发出黄色荧光。[结论]Zm MAPK5与Zmb ZIP72在植物细胞核内相互作用。     

拟南芥NBS1互作蛋白的筛选和鉴定

【目的】筛选拟南芥中NBS1的互作蛋白,探究NBS1蛋白的新功能,为后续研究奠定基础。【方法】利用酵母双杂交技术筛选拟南芥c DNA文库,对得到的序列进行BLAST比对、亚细胞定位分析和基因本体注释。【结果】共有221个阳性克隆,测序后通过BLAST比对得到97个与NBS1互作的蛋白,包括膜蛋白、转运蛋白和折叠蛋白等,它们主要定位于细胞质、细胞核和叶绿体等,主要富集于4个分子功能、5个细胞组分和13个生物过程。【结论】拟南芥中与NBS1互作的蛋白在刺激响应、信号转导和细胞代谢等方面发挥着重要作用,也证明NBS1是一种多功能蛋白,但其功能及分子机制还需进一步研究。     

玉米AGPase-bt2与GPN1蛋白互作的双分子荧光互补技术研究

【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,并用2种载体共同瞬时侵染烟草叶肉细胞,48h后在激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2与GPN1的相互作用。【结果】AGPase-bt2基因长1 428bp,GPN1基因长1 497bp。双酶切鉴定结果表明,326-CYCHA-AGPasebt2、326-CYNEE-GPN1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;携带有共转化基因的烟草叶肉细胞在激光共聚焦显微镜下观察到明显的黄色荧光现象,且黄色荧光与叶绿体自发的红色荧光位置重合。【结论】AGPase-bt2与GPN1在植物细胞中真实地存在蛋白互作。     

拟南芥转录因子AtMYB73转录活性区域分析及互作蛋白的筛选

【目的】确定拟南芥抗逆转录因子AtMYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明AtMYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子AtMYB73的酵母诱饵表达载体pAS1-AtMYB73,检测pAS1-AtMYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆AtMYB73的N端区域（含有R2R3结构域）和C端区域（不含R2R3结构域）,检测AtMYB73的N端和C端的转录激活活性,分析AtMYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以AtMYB73为诱饵筛选拟南芥的cDNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选获得的AtMYB73的候选互作蛋白进行分析。构建AtMYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体pGBDT7-AtMYB73和pGADT7-F12F1.4,通过酵母双杂交技术,对其互作关系进行分析。【结果】含pAS1-MYB73的酵母菌在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp/、SD/-Ade/-Trp培养基上均能生长,表明AtMYB73具有较高的自激活活性。含pAS1-AtMYB73的酵母菌在SD/-Trp/Amp液体培养基中培养24 h的OD₆₀₀值大于0.8,表明诱饵载体对酵母Y190没有细胞毒性。成功构建了pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C载体,获得了含有pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C的酵母;含pAS1-AtMYB73-N的酵母在含X-a-gal的YPAD培养基上呈现无色,而含pAS1-AtMYB73-C的酵母则呈现蓝色,表明AtMYB73的C端有明显的自激活性,而N端没有自激活性。以AtMYB73为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库,获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个蛋白。利用酵母双杂交技术,确定了MYB73与F12F1.4之间存在一定的互作。【结论】拟南芥抗逆转录因子AtMYB73具有较高的转录激活活性,其活性区域位于C端;以AtMYB73为诱饵,筛选获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个AtMYB73的候选互作蛋白;利用酵母双杂交技术,确定了AtMYB73与F12F1.4之间的互作关系。     

应用双分子荧光互补技术研究靶标肽与互补肽之间的互作关系

【目的】基于双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)技术研究依据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白受体结合位点肽段的靶标肽与互补肽在活细胞内的相互作用关系以及定位情况,为进一步利用该多肽进行猪流行性腹泻病毒的检测积累前期基础和提供理论支撑。【方法】依据靶标蛋白的氨基酸组成、所带电荷种类、形成分子间氢键的能力、极性的强弱、疏水性能等理化特性设计出靶标肽;根据靶标蛋白的氨基酸组成,设计出在理论上与其相互作用的互补肽,并利用生物信息学工具对靶标肽与互补肽进行预测分析;将靶标肽与互补肽的核苷酸序列分别插入EcoRΙ/XhoΙ双酶切后的pBiFC-VC155与NotΙ/SalΙ双酶切后的pBiFC-VN173载体中,构建出BiFC真核表达载体,经酶切及测序验证正确后转染Vero细胞来研究靶标肽与互补肽的互作关系以及形成的BiFC复合物在细胞内的精确定位。【结果】生物信息学分析表明靶标肽和互补肽分别带有亲水性和疏水性结构域,亲水性结构域都带有正负电荷,能够产生静电引力;酶切鉴定和测序结果表明成功构建了pBiFC-VC155-靶标...     

玉米质体型AGPase小亚基和糖酵解关键酶PPDK1互作关系的研究

【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶肉细胞,激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2和PPDK1的相互作用。【结果】双酶切试验表明,326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-PPDK1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;浸染烟草叶片后,AGPase-bt2和PPDK1在叶肉细胞中高效表达,出现BiFC荧光信号。【结论】AGPase-bt2和PPDK1在植物细胞内存在真实互作关系。     

双分子荧光互补技术（BiFC）分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作

【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。     

槲皮素促进拟南芥生长素极性运输的研究(英文)

Study on the role of quercentin in polar auxin transportation. Arabidopsis was cultured on medium supplemented with quercetin to observe the growth of hypocotyls,14C-IAA transport assays were conducted to measure the auxin transport activity. The results showed that Arabidopsis mutant aux1 which had been deficient in auxin influx transportion obviously recovered the ability after cultured on the medium with quercetin. The polar auxin transport was promoted by the addition of quercetin. These results indicated that quercetin could promote polar auxin transport in vivo.     

Quercetin Promotes Auxin Transport in Arabidopsis thaliana

Study on the role of quercentin in polar auxin transportation. Arabidopsis was cultured on medium supplemented with quercetin to observe the growth of hypocotyls,14C-IAA transport assays were conducted to measure the auxin transport activity. The results showed that Arabidopsis mutant aux1 which had been deficient in auxin influx transportion obviously recovered the ability after cultured on the medium with quercetin. The polar auxin transport was promoted by the addition of quercetin. These results indicated that quercetin could promote polar auxin transport in vivo.     

槲皮素促进拟南芥生长素极性运输的研究

用含有外源槲皮素的培养基种植拟南芥，探讨槲皮素对拟南芥生长素极性运输的影响。     

Quercetin Promotes Auxin Transport in Arabidopsis thaliana

Study on the role of quercentin in polar auxin transportation. Arabidopsis was cultured on medium supplemented with quercetin to observe the growth of hypocotyls, 14C-IAA transport assays were conducted to measure the auxin transport activity. The results showed that Arabidopsis mutant auxl which had been deficient in auxin influx transportion obviously recovered the ability after cultured on the medium with quercetin. The polar auxin transport was promoted by the addition of quercetin. These results indicated that quereetin could promote polar auxin transport in vivo.     

异三聚体G蛋白在2,4-D诱导的拟南芥根生长发育中的作用

利用拟南芥的野生型(ws)、异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体(gpa1-1和gpa1-2)和超表达突变体(wGα和cGα)为材料,通过施加不同质量浓度(0～0.010 mg.L-1)的2,4-D处理,对拟南芥根生长发育的形态指标进行了测定。结果表明:(1)随着培养基中2,4-D质量浓度的不断增大,5种基因型主根的伸长生长都受到抑制,且抑制作用随浓度升高而增强;4种突变体和野生型主根的生长在相同浓度2,4-D处理下,无明显差异;(2)2,4-D在一定浓度范围内,对拟南芥侧根的生长发育起促进作用;在2,4-D诱导的侧根生长中,相同浓度2,4-D处理下,缺失突变体明显比野生型侧根多,超表达突变体比野生型侧根少;gpa1-1和gpa1-2分别在2,4-D质量浓度为0.005mg.L-1和0.008 mg.L-1时的侧根数目与野生型差异最大。初步证明G蛋白不参与2,4-D诱导的拟南芥主根生长发育的调节,而在侧根生长发育中可能起负调节作用。     

异三聚体G蛋白在IAA诱导的拟南芥根生长发育中的作用

以拟南芥的野生型（ws）和异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体（gpa1-1,gpa1-2）和超表达突变体（wGα,cGα）为材料,通过施加不同浓度（0~0.8 mg/L）的IAA处理,对拟南芥根生长发育的一些形态指标进行了观测比较。结果表明：①随着培养基中IAA浓度的不断升高,5种基因型主根的伸长生长都受到抑制,且抑制作用随浓度升高而增强;4种突变体和野生型主根的生长在相同浓度IAA处理下,无明显差异;②IAA在一定浓度范围内,对拟南芥侧根的生长发育起促进作用;在相同浓度IAA诱导的侧根生长中,缺失突变体明显比野生型侧根多,超表达突变体比野生型侧根少。初步证明,G蛋白不参与主根生长发育的调节,而在侧根生长发育中可能起负调节作用。     

拟南芥中一个与ABA信号途径相关未知蛋白质的研究初报

利用酵母双杂交系统在拟南芥cDNA文库中筛选出1个与ABI2有相互作用的未知蛋白质（AC）。在酵母系统中的进一步研究表明，AC与ABI1、ABI2有相互作用，其作用依赖于ABI1、ABI2的PP2C活性。在大肠杆菌中表达和纯化了与预测结果一致的AC蛋白质。构建了真核过量表达载体，转化拟南芥后筛选和鉴定出转基因AC植株。转基因植株的生理性状分析表明，AC基因的过量表达降低了植物对ABA敏感性。研究初步证明AC可能是脱落酸信号传导途径中的1个新信号分子。