cDNA文库构建策略及其在盐生植物中的应用

构建各种cDNA文库是目前发现新基因的基本策略,同时也是功能基因组学研究的一个主要方法.cDNA文库主要包括cDNA全长文库、cDNA差减文库和cDNA均一化文库等类型,各种文库的原理、构建方法和适用范围都有很大的不同.近年来,通过构建各种cDNA文库、获得大规模高质量EST数据库,并在此基础上分离克隆抗逆相关基因已经成为研究植物耐盐机理的重要途径.旨在对cDNA文库的主要类型及其构建策略,以及cDNA文库在盐生植物新基因筛选中的应用进行综合论述,并对植物耐盐机制的研究提出了展望.     

橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。     

水稻高盐胁迫下的酵母双杂交文库构建及OsRPK1胞内互作蛋白质的筛选

为了挖掘水稻OsRPK1胞内互作蛋白质,阐明OsRPK1参与高盐胁迫的分子机制,本研究利用SMART技术,构建水稻高盐胁迫下根尖的酵母双杂交文库。PCR扩增获得OsRPK1基因编码胞内区域的碱基序列,构建诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),检测诱饵表达载体在酵母中的毒性和自激活活性,筛选OsRPK1胞内互作蛋白,进一步分析高盐胁迫下候选基因的表达模式。结果表明,构建的cDNA文库库容量为1.11×10~7 CFU,文库重组率为96%,文库插入片段多态性较好。成功构建了诱饵表达载体(pGBKT7-OsRPK1-CD),经检测诱饵表达载体无毒性,无自激活活性。诱饵表达载体与cDNA文库进行双杂交筛选,经测序和比对分析获得了11个重要的候选基因,检测候选基因在高盐处理下的表达情况,其中8个候选基因受高盐诱导表达,2个候选基因受高盐胁迫抑制表达,1个候选基因受高盐胁迫瞬时诱导表达后表达量又受到显著抑制。     

盐、碱条件下水稻剑叶形态相关性状QTL分析

以东农425和耐盐碱的长白10号杂交获得重组自交系(RIL)为作图群体,对亲本重测序,利用差异设计120对Indel引物,在实验室原有102个SSR标记基础上增加113个多态性较好Indel标记,构建遗传连锁图谱,鉴定水稻耐盐、碱性。以浓度6 ds·m-1的Na Cl水溶液,p H 9.0 Na2 CO3水溶液作全生育期处理,正常水灌溉为对照。2016~2017年盐、碱胁迫和自然条件下测定水稻抽穗期对剑叶形态相关性状,并对各性状作QTL定位。结果表明,在两年试验中亲本和RIL群体受碱胁迫影响大于盐胁迫,亲本每个性状在盐、碱两种条件下均表现显著相关性,在盐、碱胁迫条件下共检测到26个与剑叶形态性状相关QTL。q SLl9和q ALl8在两年试验中均被检出,是两个主效QTL。研究结果可为水稻抽穗期耐盐、碱性QTL精细定位和分子辅助育种提供理论依据。     

受条斑病菌侵染的水稻cDNA文库构建

提取经条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)侵染诱导后的水稻mRNA,利用SMARTTM技术于载体pGADT7-SfiAB上构建了水稻cDNA文库.检测发现,文库中含有水稻病程相关蛋白基因OsPR-1a、OsPR-1b和PAL.随机提取cDNA文库克隆的质粒,酶切分析发现,该cDNA文库的插入片段分布在500～2 000 bp之间,平均大小约为1 kb,重组率达95%.上述结果表明,水稻受条斑病菌侵染的cDNA文库质量较好,这为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定了工作基础.     

胡杨(Populus euphratica)盐相关基因的克隆

以2年生胡杨实生苗为研究材料，通过用119mmol／L的NaCl溶液浇灌处理1h，分别收集NaCl处理前后的细嫩白根设立对照样品与处理样品，分离rnRNA。用抑制性扣除杂交技术建立胡杨盐处理的cDNA扣除文库，并以cDNA阵列杂交技术用。。P标记探针进行杂交，共筛选672个有效克隆，从中确认3个探针进行了序列分析，其中1个为盐抑制表达基因片段，2个为盐诱导表达基因片段。分析表明，1个盐诱导表达基因片段为1含188氨基酸开放阅读框的EST，该EST具有1079个核苷酸。该结果与我们早先检测到的1个胡杨盐诱导表达蛋白大小相符。     

盐碱胁迫下玉米EST数据库对比分析

提取了盐碱胁迫处理的玉米YQ7-96品系3叶1心期的叶茎混合组织总RNA,运用SMART技术构建p DNR-LIB载体的cDNA文库,并随机挑选克隆进行EST序列的Blast X比对和MIPS归类分析。结果发现,在随机挑取的2个4 000个cDNA克隆测序中,95.0%的EST符合分析要求(长度大于150 bp,非rRNA),共获得3 217条拥有Blast X注释信息的EST序列,盐碱胁迫的EST数据库归类的比例信息比较接近。其中维持正常生理活动占比分别为50.63%(盐胁迫)和52.79%(碱胁迫),参与细胞内运输、细胞内信号传导、细胞防御和细胞循环和DNA代谢过程的基因分别为22.05%(盐胁迫)、19.03%(碱胁迫),参与能量代谢和转录相关的基因分别为15.77%(盐胁迫)、15.36%(碱胁迫)。本研究构建的盐碱胁迫下玉米cDNA文库及相关基因表达分析结果,为后续研究提供了基础数据。     

一种构建全长cDNA文库的方法

建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.     

棉花蕾铃离层脱落相关基因的克隆及其表达分析

[目的]研究激素与棉花蕾铃脱落的关系,为解析离层脱落相关基因的表达、调控及功能鉴定提供基础资料.[方法]以50 mg/L赤霉素(GA3)和250 mg/L乙烯利(CEPA)分别处理的棉花蕾铃离层cDNA为Tester,H2O处理的棉花蕾铃离层cDNA为Driver,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建经GA3和乙烯处理后的消减文库,反向Northern blo-tting筛选出离层差异表达的EST序列,然后进行基因功能注释与功能分类,并分析蕾铃离层差异表达基因的组织表达模式和GA3诱导表达规律.[结果]以GA3处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为GA文库;以CEPA处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为CE文库.从构建的两个消减文库(GA和CE)中共筛选出29个在离层差异表达的EST序列,通过基因功能注释与功能分类,可将这些EST序列分为翻译相关、代谢相关、信号传导、转录相关、蛋白合成、能量代谢、抗逆相关、基因组序列和未知功能等九大类,其中与翻译相关的EST序列占24.14%,说明经激素处理后棉花蕾铃离层有大量的蛋白合成.从消减文库中挑选10个差异表达基因(EST序列)进行RT-PCR分析,结果发现以GA3处理棉花蕾铃离层后部分相关基因的表达模式会发生变化.[结论]棉花蕾铃离层经激素处理后能激活脱落相关基因的表达,进而影响器官脱落,是其对逆境胁迫反应的结果.     

白粉菌诱导的中国野生毛葡萄抑制消减文库构建及EST序列分析

【目的】构建白粉菌诱导下中国野生毛葡萄"商-24"的抑制消减文库,获得抗白粉病差异表达基因EST序列。【方法】应用抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建白粉菌诱导下高抗白粉病的中国野生毛葡萄"商-24"叶片SSH-cDNA文库,通过生物信息学方法对文库中的EST序列进行分析。【结果】成功构建了白粉菌诱导的中国野生毛葡萄"商-24"抑制消减cDNA文库,对消减文库测序后获得了200个EST序列,大小为300～1000bp;BLAST分析表明,其中19个EST序列与已知功能基因序列同源性很高,分别参与了植物的防卫反应、胁迫反应、细胞解毒和信号转导等。【结论】获得了葡萄抗白粉病的EST序列,这为进一步克隆抗葡萄白粉病基因、探明其抗病分子机理奠定了基础。     

栽培番茄耐盐突变体的离体筛选

栽培番茄品种“矮黄”的子叶作为外植体诱导愈伤组织 ,用 Na Cl进行直接高盐胁迫筛选。结果表明 ,2 2 5 mmol/LNa Cl直接高盐胁迫获得了耐盐突变体 ,1 0株完整的再生耐盐植株 ,在 1 5 0 mmol/L Na Cl的盐胁迫下 ,成活率可达 70 % ,而未经胁迫筛选过的原始株成活率则为零。其中 ,1株耐盐突变株能正常开花、结果。对其后代离体培养的茎尖和下胚轴外植体耐盐性进行比较 ,表明其后代仍然保持耐盐性     

干旱和盐碱共胁迫玉米EST数据库分析(英文)

[目的]构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库,对细胞功能相关基因表达进行初步分析。[方法]提取处理玉米YQ7-96品系的雌雄分化期(12片叶龄)的混合组织(叶、茎和花芽)总RNA,运用SMART技术构建pDNR-LIB载体的cDNA文库,并随机挑选克隆进行EST序列的BlastX比对和MIPS归类分析。[结果]随机挑取3 027个cDNA克隆进行测序,94.45%的EST长度大于400 bp,共获得1 861个单基因簇,其中维持正常生理活动的基因占65.36%;参与细胞内运输、细胞内信号传导、细胞防御和细胞循环和DNA代谢过程的基因分别占9.26%、6.58%、2.63%和3.16%。[结论]在成功构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库的基础上,对产生的EST进行了测序和分析归类,筛选出了细胞功能相关EST,为后续研究奠定了基础。     

干旱和盐碱共胁迫玉米EST数据库分析

[目的]构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库,对细胞功能相关基因表达进行初步分析。[方法]提取处理玉米YQ7-96品系的雌雄分化期（12片叶龄）的混合组织（叶、茎和花芽）总RNA,运用SMART技术构建pDNR-LIB载体的cDNA文库,并随机挑选克隆进行EST序列的B lastX比对和MIPS归类分析。[结果]随机挑取3 027个cDNA克隆进行测序,94.45%的EST长度大于400 bp,共获得1 861个单基因簇,其中维持正常生理活动的基因占65.36%;参与细胞内运输、细胞内信号传导、细胞防御和细胞循环和DNA代谢过程的基因分别占9.26%、6.58%、2.63%和3.16%。[结论]在成功构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库的基础上,对产生的EST进行了测序和分析归类,筛选出了细胞功能相关EST,为后续研究奠定了基础。     

干旱和盐碱共胁迫下玉米EST文库的构建与分析

为了构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库,提取YQ7-96品系的雌雄分化期(12片真叶)的混合组织(叶、茎和花芽)总RNA,运用SMART技术构建pDNR-LIB载体的cDNA文库,随机挑选克隆进行表达序列标签(EST)序列的BlastX比对和MIPS归类分析。结果表明:表达频率10的只有1个独立基因,表达频率4以上的有17个独立基因,单拷贝基因有1 693个。在基因注释中发现了4个编码早期干旱诱导蛋白质的EST,在聚类分析后得到一个片段重叠群,命名为EDIP。重叠群与玉米、水稻的早期干旱诱导蛋白质相关基因有较高的同源性,表明在干旱和盐碱共胁迫的玉米EST数据库中,高频表达的基因较少,大部分为单拷贝基因;另外,已筛选出与干旱和盐碱共胁迫相关的玉米EST。     

粗山羊草（Ae.tauschii）幼苗和根全长cDNA文库构建及其EST注释与比较分析

 【目的】构建小麦D基因组供体粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，探讨利用生物信息学方法分析发掘组织特异性表达基因的可行性。【方法】本研究利用Cap-trapper方法构建全长cDNA文库，利用高通量测序技术获得大批高质量EST序列，在基于Linux系统的本地化生物信息学分析平台上对上述EST进行了电子注释分析。【结果】成功构建了粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，测序获得根EST序列6 973条和叶EST 6 616条。利用本地化数据分析平台对其进行功能注释。利用GO-Diff软件，发现了两个文库间表达基因的功能差异，找到组织间表达差异显著的基因和组织内特异性表达的基因。【结论】利用构建的全长cDNA测序获得大量EST序列，通过生物信息学方法挖掘差异表达或特异性表达基因的方法是可行的。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

紫外线胁迫的花生幼果cDNA文库构建与RS cDNA的分离

紫外线胁迫可导致花生产生白藜芦醇的诱导合成防御反应,本研究在利用UV处理花生幼果、激发花生幼果防御反应的基础上提取总RNA,应用SMART-cDNA文库构建试剂盒构建了花生幼果的cDNA文库.该文库含有1.0×106独立克隆,插入片段平均1 kb左右.利用所构建的cDNA文库,采用96孔板PCR筛选方法,分离获得2个白藜芦醇合成酶cDNA.     

尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。     

蜡梅花cDNA文库构建及其高频出现脂转移蛋白cDNA的表达

【目的】构建蜡梅花cDNA文库，分析蜡梅脂转移蛋白基因的表达，为探索蜡梅冬季开花分子机理，分离克隆特色基因奠定基础。【方法】以蜡梅花器官为材料，用SMART cDNA Library Construction Kit 构建文库，RT-PCR分析基因表达。【结果】经测定原始文库滴度达到1.4×106 pfu/ml，扩增总文库滴度约为1010pfu/ml，重组率达到96%，插入片段在0.5 kb 以上，平均约1.1 kb，通过PCR 检测，从总文库中检测到了表达丰度不同的蜡梅PI、AP3和LTP基因的特异片段，说明所构建的文库覆盖度高、代表性强，LTP基因具有内含子，而总文库中扩增出的LTP基因不含内含子，说明所构建的cDNA文库无基因组DNA污染， LTP基因在蜡梅开花各个时期均表现较高的转录水平，与EST分析时高频率出现LTP序列的情况相符，证实所构建的文库能够反映蜡梅开花过程基因表达的基本情况。【结论】已获得高质量的蜡梅花cDNA文库，可以用于进一步的基因克隆或EST测序分析，这是首次正式报道蜡梅cDNA文库的构建。LTP基因在蜡梅开花过程中可能具有重要的生物学功能，为探索蜡梅冬季开花分子机理提供了线索。