尖孢镰刀菌致病菌营养体亲和群研究

在分离、鉴定侵染黄瓜的尖孢镰刀菌的基础上，测定30个尖孢镰刀菌菌株（包括6个专化型）对黄瓜的致病性和营养体亲和性。研究结果表明，侵染我国黄瓜的尖孢镰刀菌至少有5个以上的营养体亲和群（VCGs)，除来自黑龙江的9909－1菌株与膜的黄瓜根茎腐专化型（Fusarium axysporum f.sp.radicis-cucmeinun,FOCS)菌株属同一亲和群外，其它菌株均与希腊的尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F.o.f.sp.cucumerinum,FOC)和FORC不亲和，本文所测定的尖孢镰刀非致病菌株均与致闰 株不亲和，不同专化型的尖孢镰刀菌菌株归属于不同的营养体亲和群。研究结果初步显示了应用营养体亲和性区分菌的致病性及专化型的可能性。     

尖孢镰刀菌粘团专化型线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因敲除突变体的构建与表型分析

【目的】研究线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因在尖孢镰刀菌粘团专化型中的功能。【方法】利用同源重组原理,采用PEG介导原生质体的转化方法获得基因敲除突变体,并分析其表型和致病力。【结果】敲除Tom7基因导致尖孢镰刀菌的生长速率减慢,菌丝出现波浪状弯曲生长,产孢量增加,对氧胁迫和渗透胁迫敏感,但对其毒力无影响。【结论】由此推测线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因缺失后,影响线粒体蛋白转运功能,进一步对尖孢镰刀菌的生长发育和产孢造成影响。     

香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种mon1基因敲除转化子的表型分析及致病力测定

根据笔者实验室前期蛋白质组学研究成果,发现尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中的mon1基因影响了尖孢镰刀菌的致病性,为了研究mon1基因在Foc4侵染香蕉过程中的具体作用,利用同源重组方法敲除了Foc4的mon1基因,并对获得的敲除突变体开展表型分析和致病性测定。结果表明,与Foc4野生型菌株相比,敲除突变体生长缓慢、菌丝变细,分支减少及产孢量降低,菌株抵抗外源氧胁迫、细胞壁穿透能力、纤维素利用能力减弱,对巴西蕉苗的致病力明显减弱。由此推测mon1基因在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有一定的作用。     

通过缺失大丽轮枝菌Vdku80构建其高效基因敲除受体菌株

【目的】验证大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）非同源末端连接途径关键基因Vdku80的功能,构建高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。【方法】利用常规基因敲除的方法,构建大丽轮枝菌Vdku80基因缺失的突变体菌株ΔVdku80。即将Vdku80的同源重组DNA片段（Vdku80的基因组上下游DNA片段之间连接潮霉素抗性基因）通过农杆菌介导的转化转入大丽轮枝菌,通过同源区段的重组,潮霉素抗性基因便会替换掉野生型Vdku80,从而获得突变体菌株ΔVdku80。对突变体菌株ΔVdku80的生物学表型,即生长速率、产孢量和对棉花的致病性进行测试。分别以大丽轮枝菌野生型菌株和ΔVdku80作为受体菌株,采用上述基因敲除方法测试2个几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除效率。【结果】成功构建了Vdku80缺失突变体ΔVdku80。野生型和突变体菌株ΔVdku80在PDA培养基上的菌落形态相似,且培养8 d后菌落直径无明显差别。野生型和突变体菌株ΔVdku80产孢高峰均出现在摇瓶培养后第5天,且该时期产孢量亦无明显的变化。浓度为0.02%的MMS对野生型和突变体菌株ΔVdku80的生长均有明显的抑制作用,且抑制程度相同。接种野生型和突变体菌株ΔVdku80 4周后,棉株真叶均开始表现出萎蔫、褪绿等发病症状,野生型和突变体菌株ΔVdku80对棉花造成的病情指数分别为54.2±4.9和53.6±5.4,亦无明显变化。因此,突变体菌株ΔVdku80的生长速率、产孢量和致病性相对于野生型菌株均未发生明显变化。使用野生型菌株作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为44%和31%;而使用ΔVdku80作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为94%和87%。【结论】Vdku80缺失的菌株ΔVdku80作为受体菌株可以提高其他基因的基因敲除效率,且Vdku80的缺失对大丽轮枝菌的生长速率、产孢量和致病性均无影响,因此不会干扰其他基因的敲除所带来的表型变化。Vdku80缺失的菌株ΔVdku80可作为高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。     

玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析

【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。     

贵州山豆根根腐病病原菌鉴定

【目的】明确贵州山豆根根腐病的病原菌种类,为山豆根根腐病的防治及抗病育种提供理论基础。【方法】采用保湿培养法和组织分离法对感染根腐病的山豆根植株组织进行病原菌分离和纯化,根据柯赫氏法则对代表性菌株进行致病力测定;结合形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定。【结果】从收集的病株组织样本中共分离获得200株真菌菌株,选取在PDA培养基上菌落形态差异明显的67株菌株进行ITS测序并在NCBI数据库进行BLASTn比对分析,结果显示,67株菌株中包含尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）35株、茄腐镰刀菌（F.solani）7株、粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）23株和帚状弯孢聚壳（Eutypella scoparia）2株。致病性测定结果表明,尖孢镰刀菌代表性菌株和茄腐镰刀菌代表性菌株均可侵染山豆根引起典型的根腐病症状,且茄腐镰刀菌致病性明显强于尖孢镰刀菌。结合形态学特征和分子生物学鉴定结果,确认分离得到的病原菌分别为尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌。【结论】贵州山豆根根腐病主要由尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌复合侵染引起。     

尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸生物标记鉴别特性

【目的】分析不同寄主尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记的结构组成和分布特性,建立尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸生物标记鉴别模型。【方法】通过脂肪酸鉴定系统（Sherlock MIS）对来自于西瓜、香蕉和花生寄主的22株尖孢镰刀菌进行脂肪酸生物标记检测,采用聚类分析方法分析尖孢镰刀菌脂肪酸的同质性,采用主成分分析提取尖孢镰刀菌寄主专化型特征脂肪酸,利用Bayes逐步判别方法,建立尖孢镰刀菌寄主专化型判别模型。【结果】从供试的22个菌株中检测到8种脂肪酸,其中常见脂肪酸有6条,相对含量60%以上的主要脂肪酸有16:0、18:0 和18:2 CIS 9,12/18:0a。对常见脂肪酸进行聚类分析,结果表明脂肪酸与尖孢镰刀菌寄主专化型的系统发育存在着对应关系。对常见脂肪酸进行主成分分析,得到尖孢镰刀菌脂肪酸中的特征脂肪酸有5个,分别为14:0（X1）、16:0（X2）、16:1 CIS 9（W7）（X3）、18:0（X4）和18:2 CIS 9,12/18:0a（X5）。利用Bayes逐步判别分析,建立的尖孢镰刀菌寄主专化型判别模型为Y1=-183.06+12.24X1+8.05X2+5.39X4+3.58X5、Y2=-174.09+10.40X1+ 7.96X2+5.40X4+3.42X5、Y3=-173.97+ 14.85X1+7.25X2+ 6.58X4+ 3.53X5,当1≤Yi＜2时,菌株的寄主为西瓜;当2≤Yi＜3时,菌株的寄主为香蕉;当Yi＞3时,菌株的寄主为花生,且模型判对的概率为0.91。利用这套模型,对从西瓜、香蕉、花生上采集的56株尖孢镰刀菌寄主专化型进行判别,准确率达92.86%。【结论】脂肪酸生物标记可以作为尖孢镰刀菌寄主鉴别指标,脂肪酸14:0、16:0、18:0、18:2 CIS 9,12/18:0a是判别尖孢镰刀菌寄主的4个重要指标,建立的判别模型比较符合实际,有很好的应用价值。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

辽宁省黄瓜枯萎病病原菌种类鉴定

在沈阳、锦州、朝阳、丹东、大连采集典型黄瓜枯萎病株标样197个,对单孢分离获得的5个代表菌株 Co13、Co17、Co39、Co56、Co76进行了致病性试验及观察鉴定。结果分离出尖孢镰刀菌占74.7%,木贼镰刀菌占8.6%,茄病镰刀菌占6.9%,半裸镰刀菌占0.8%,串珠镰刀菌占4.7%。其中以尖孢镰刀菌分离频率最高,是优势菌株,致病性最强。证明辽宁省黄瓜枯萎病菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxys-porum t.sp.Cucumerinum)。     

黄瓜种传镰刀菌种类的鉴定及其致病性研究

为明确我国主栽黄瓜品种的种子中携带镰刀菌的种类及其危害,对来自我国黄瓜主产区21个黄瓜品种的种子进行种传镰刀菌检测,从种胚和种子外部分离得到镰刀菌分离物9个,采用形态学及分子生物学的方法进行鉴定,并研究其对黄瓜种子发芽和幼苗致病性的影响.结果表明:9个分离物中,4个分离物为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),4个分离物为串珠镰刀菌(F.moniliforme),1个分离物为再育镰刀菌(F.proli feratum).4个尖孢镰刀菌分离物对黄瓜种子发芽均有显著影响,发芽指数、活力指数、根长和鲜重等指标均显著降低,且能导致黄瓜幼苗出现典型的枯萎症状,经柯赫氏法则检验证明其具有致病性.其他分离物对黄瓜种子发芽也有一定的抑制作用,但没有致病性.     

灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能

【目的】明确灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能,为阐明该基因调控灰葡萄孢生长、发育和致病的分子机理奠定基础,并为灰霉病的防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法,对BcKMO及其编码产物进行分析。扩增BcKMO的编码区,与pBARKS1-eGFP载体连接,构建基因的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP;利用PEG介导的原生质体转化方法,转化BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183的原生质体;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术,对所获得转化子进行鉴定;对野生型菌株BC22、突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型（菌落形态、菌丝形态、生长速度、产孢量等）和致病力进行分析。【结果】BcKMO编码犬尿氨酸单氧酶（kynurenine 3-monooxygenase,KMO）,含有单氧酶FAD的保守结构域和4个类似芳香环羟化酶（Aromatic-ring hydroxylase-like）的基序,与核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的Rossmann卷曲NAD(P)(+)-结合蛋白（Rossmann-fold NAD(P)(+)-binding proteins,gi156049701）和从线嘴壳（Ophiostoma piceae）的FAD依赖性氧化还原酶（FAD-dependent oxidoreductase,gi512192943）同源性较高。成功构建了BcKMO的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP,利用PEG介导的转化方法,转化突变体BCG183的原生质体,获得了草胺膦抗性的转化子;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术鉴定转化子,获得了BcKMO的回复突变体BCG183/BcKMO。对突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型进行了分析,发现BCG183突变体的生长速率减慢,不产生分生孢子和菌核,菌丝纤细;回复突变体和野生型菌株的生长速率、菌丝形态基本一致,均产生分生孢子和菌核。致病力分析发现,BCG183突变体在芸豆叶片和黄瓜叶片上的致病力均较野生型和回复突变体明显增强。【结论】灰葡萄孢BcKMO正调控病菌的生长、发育,负调控病菌的致病力。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌１号和４号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T—DNA插入突变体的筛选

【目的】通过农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量（试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度）试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为：农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25 ℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化,转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。     

豌豆镰孢根腐病菌的鉴定及其致病基因多样性

【目的】明确中国不同地区豌豆镰孢根腐病菌的种类及其致病基因多样性,为病害防治及抗病育种提供依据。【方法】通过形态学观察、致病性测定和特异性分子标记检测对病原菌分离物进行鉴定,通过茄镰孢豌豆专化型（Fusarium solani f. sp. pisi）致病基因特异性PCR引物对病原菌分离物致病基因进行检测。【结果】96个病原菌分离物鉴定为茄镰孢豌豆专化型。致病性测定表明所有分离物对豌豆品种“草原27”致病,其中81.3%的分离物致病力强,10.4%的分离物致病力中等,只有8.3%的分离物具弱致病力。用4个致病基因PDA、PEP1、PEP3和PEP5 特异性引物对分离物基因组DNA进行PCR扩增,在96个分离物中共检测到10种基因组合（基因型）,其中含有4个基因组合和3个基因组合的分离物约占91%,这些分离物绝大多数具有强致病力（87.4%）或中等致病力（9.2%）,而检测不到PDA的分离物基本上都是弱致病力类型,表明致病基因的种类和数量与茄镰孢豌豆专化型的致病力水平有关。【结论】茄镰孢豌豆专化型是引起中国豌豆根腐病的主要病原菌,豌豆主产区大多数分离物致病力强。     

氟唑活化酯对黄瓜抗枯萎病的诱导作用

【目的】诱导抗病剂可以诱导寄主植物的系统抗病性作用,具有持效性和广谱性的特点,研究旨在明确新型诱导抗病剂氟唑活化酯（fluoro-substituted benzothiadiazole derivatives,FBT）对黄瓜抗枯萎病的诱导作用,为该化合物的诱导抗病性机理的深入研究提供参考。【方法】利用50 mg·L^-1 FBT在黄瓜苗期移栽前3-4片真叶时喷雾诱导1次,3 d后移栽定植于含有黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen）的土壤中,缓苗后以叶面喷雾的方式进行第2次诱导,之后每隔7 d喷雾诱导1次,共诱导3次,对照诱导抗病剂苯并噻二唑（BTH）也采用同样的诱导方法,对照杀菌剂70%甲基硫菌灵可湿性粉剂1 500倍液则采用灌根施药,通过调查病情指数以评价其对枯萎病的抗病作用;研究FBT对枯萎病菌侵染黄瓜的影响,将供试黄瓜催芽至0.5 cm胚根后,浸泡于50 mg·L^-1 FBT中胚根诱导1次,待播种后黄瓜生长至2片子叶期开始第2次诱导,以后每隔7 d诱导1次,共诱导3次,第3次诱导后24 h灌根接种黄瓜枯萎病菌,并于接种后1、3、5、7、9、11、14、16、20、24、29 d分别取黄瓜根组织,于冰水中清洗,利用酸性品红染色技术评价FBT诱导黄瓜后对枯萎病菌侵染的影响,利用Maule反应和甲苯胺蓝染色技术评价FBT对黄瓜根组织中木质素和酚类物质的沉积情况的影响,利用分光光度-比色法测定FBT诱导黄瓜后根组织中富含羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）及β-1,3-葡聚糖酶活性,以分析FBT诱导黄瓜后根组织抗病性变化情况。【结果】诱导抗病性表达发现,50 mg·L^-1的FBT对黄瓜抗枯萎病的诱导效果可达62.01%,高于对照诱导抗病剂BTH和杀菌剂70%甲基硫菌灵可湿性粉剂的防治效果。FBT诱导后的黄瓜在接种后7 d开始有枯萎病菌的侵染,此时未诱导只接种的黄瓜根组织因受枯萎病菌侵染,已经出现大量菌丝及孢子,FBT的诱导增强了寄主的抗病性反应,从而抑制了病原菌的侵染。同时经FBT诱导后4 d未接种及诱导后接种两个处理的根组织中具有大量褐色木质素沉积,尤其是根表皮细胞壁及韧皮部木质素沉降量明显,表现深褐色。对酚类物质的观察发现,在FBT诱导后2 d开始出现酚类物质沉积,诱导后4和6 d时,根组织中荧光信号较强,酚类物质沉积量较大,诱导后8 d时,根组织中荧光信号消失,酚类无明显沉积,木质素和酚类物质积累量的增加,以达到增强细胞壁的抗性,抵御病原菌的侵染的作用。在FBT诱导后1 d抗病相关蛋白HRGP和β-1,3-葡聚糖酶活性也明显增强,并一直保持在较高水平,为抵御病原菌侵染做准备。【结论】FBT诱导黄瓜产生了对枯萎病的抗病作用,同时黄瓜根组织通过次生代谢物质沉积量的增加及抗病相关蛋白活性增强,达到增强寄主根组织细胞壁的抗性,从而抵御病原菌的侵染,是具有发展前途的新型诱导抗病剂。     

接种枯萎病菌对甜瓜木质素合成相关酶活性及CmCADs表达的影响

【目的】明确接种枯萎病菌对甜瓜幼苗植株表型、木质素含量、木质素合成相关酶活性及肉桂醇脱氢酶（cinnamy alcohol dehydrogenase,CAD）基因表达的影响,找出响应枯萎病菌的CmCADs成员。【方法】选用抗枯萎病品种薄皮甜瓜‘彩虹7号’为试验材料。在甜瓜幼苗长至“三叶一心”时接种枯萎病菌-尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. melonis)。以长势相同的健康植株浇灌等量无菌水为对照。在接种后0、1、3、5、7和9 d观察甜瓜植株表型变化,并测定其营养器官中的木质素含量、木质素合成关键酶（苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和CAD）活性及CmCADs的表达量。【结果】接种枯萎病菌后,甜瓜植株表型发生明显变化。在接种枯萎病菌后5 d甜瓜植株叶片出现轻微萎蔫,接种后9 d植株全部叶片均已萎蔫。甜瓜营养器官中木质素含量及木质素合成相关酶PAL、POD和CAD活性在接种枯萎病菌后与对照相比均有不同程度的升高。其中木质素含量在根、茎和叶中呈现出一致的变化趋势,即木质素含量均随着接种枯萎病菌后天数的延长而增加,且显著高于对照。PAL活性在甜瓜根和茎中呈现先升高后下降的变化趋势,在叶片中整体呈现升高的趋势且显著高于对照。POD活性在各时期均高于对照并呈现出不同的变化趋势。CAD活性在甜瓜根、茎、叶中变化趋势一致,均呈现先升高后下降的趋势。接种枯萎病菌后,CmCADs各成员在甜瓜营养器官中的表达表现出组织特异性。根中除CmCAD4外,其他4个成员均在接种后7 d受强烈诱导。茎中各成员均无表达,而叶中CmCAD2和CmCAD5在接种后5 d受到强烈诱导。【结论】与对照相比,甜瓜营养器官中木质素含量及木质素合成相关酶PAL、POD和CAD活性在接种后均升高,表明木质素合成途径可能在甜瓜抵御枯萎病中起重要作用,根和叶中均受枯萎病菌诱导表达的CmCAD2和CmCAD5可能是响应枯萎病菌的CmCADs成员,并在甜瓜抗枯萎病中起一定作用。     

灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因BcKMO调控病菌致病力的机制分析

【目的】揭示灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因BcKMO（kynurenine 3-monooxygenase）调控病菌致病力的机制,阐明灰葡萄孢致病的分子机理。【方法】利用DNS和Hoffman方法,对BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复突变体（BCG183/BcKMO）的多聚半乳糖醛酸酶（PMG）、果胶酶（PG）、纤维素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）和果胶甲基反式消除酶（PMTE）的活性进行分析;提取灰葡萄孢野生型和BCG183、BCG183/BcKMO突变体的粗毒素并进行生物活性测定;利用溴百里酚蓝显色试验,对突变体BCG183和BCG183/BcKMO的产酸能力进行分析;利用洋葱表皮穿透试验,检测突变体BCG183和BCG183/BcKMO的穿透能力;利用real-time PCR技术,检测突变体BCG183和BCG183/BcKMO中已知致病相关基因腺苷酸环化酶编码基因Bac、异源三聚体G-蛋白G?亚基基因Bcg2和Bcg3、蛋白激酶调节亚基基因PkaR、MAP激酶编码基因Bmp1和Sak1、MAP激酶Bmp3和BcSak1下游的靶基因Bcreg1、TCHK-MAPK信号途径基因Bos1、亲环蛋白A编码基因Bcp1、小G蛋白基因Ras2、多聚半乳糖醛酸酶基因Bcpg1和超氧化物歧化酶基因Sod1的表达水平。【结果】突变体BCG183中的PMG和PG的酶活性较野生型和回复突变体明显增强,CX、PGTE和PMTE的酶活性与野生型和回复突变体没有明显差别;突变体BCG183的毒素活性较野生型和回复突变体明显增强;突变体BCG183的产酸能力较野生型和回复突变体明显减弱;突变体BCG183能够穿透洋葱表皮,在培养基上形成菌落,与野生型和回复突变体没有明显差别;突变体BCG183中已知致病相关基因Bac、Bcg2、Bcg3、PkaR、Bmp1、Sak1、Bcreg1、Bos1、Bcp1、Ras2、Bcpg1和Sod1的表达水平明显强于野生型和回复突变体。【结论】灰葡萄孢BcKMO通过调控病菌的胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力、致病相关基因的表达而影响病菌的致病力。     

苹果树腐烂病菌GTP-环化水解酶II基因敲除载体构建及其突变体的表型分析

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1（暂命名）,该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因（hph）进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切,通过T4连接酶,将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,转化到JM109菌株中,挑取阳性克隆,提取质粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除载体,再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体,然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体,最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体,并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化,共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株,经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证,得到1个敲除突变体,编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上,敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm?d-1,03-8平均生长速率为24.67 mm?d-1,突变体菌落生长速率明显变慢,颜色变浅,气生菌丝稀疏;ΔVmgtp1-90光照培养40 d仍无繁殖体的产生,而03-8光照条件下培养15 d后就能产生繁殖体,30 d后有分生孢子从繁殖体上溢出。致病性检测试验发现,接种ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士苹果枝条上病斑的平均直径为9.3 mm,与之相比,接种03-8的苹果枝条病斑平均直径为24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性显著减弱。【结论】通过基因敲除和遗传转化获得苹果树腐烂病菌中表达GTP环化水解酶II Vmgtp1的敲除突变体ΔVmgtp1-90,比较Vmgtp1突变体与野生型菌株的表型及致病性差异,发现Vmgtp1可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝生长和繁殖体的产生过程,并且可能在苹果树腐烂病菌致病过程中起作用,但是是否起主要作用还有待进一步研究。