水稻品种对水稻条纹病毒及其介体灰飞虱的抗性鉴定

经生物学接种鉴定了３８个水稻品种对水稻条纹病毒（ＲＳＶ）的抗性,其中２９个分别为江苏、云南、辽宁、福建水稻种植区的主栽品种,结果表明,除福建外,其他３个水稻种植区的主栽品种都表现中感或高感,这可能是这３个稻区病害发生严重的原因之一,鉴定了１２个品种对ＲＳＶ介体灰飞虱的抗性,其中有４个品种表现为抗虫,但抗性较低,研究了１０个品种抗病性与抗虫性之间的关系,结果发现,４个品种对灰飞虱的抗虫性与其     

受褐飞虱诱导的水稻酵母双杂交文库的构建

为了研究水稻抗褐飞虱的分子机制,构建了受褐飞虱取食诱导的水稻的酵母双杂交文库。检测结果表明构建的文库容量为2.22×106 CFU,文库滴度为5.4×107 CFU/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～1 000 bp之间。     

灰飞虱携带的水稻条纹病毒免疫检测

利用间接ELISA方法和DIBA方法对采自江苏省不同地区灰飞虱的带毒率进行检测,结果发现各地灰飞虱的带毒率比较高,这是江苏省水稻条纹叶枯病严重发生的主要因素。对两种检测方法比较发现,DIBA方法更快速、实用,也更加灵敏,适合于基层工作人员直接检测灰飞虱携带的病毒,从而为病害的流行预测提供依据。     

灰飞虱与水稻条纹病毒亲和性相关的RAPD标记研究

采用47个随机引物对高亲和性灰飞虱群体与非亲和性灰飞虱群体进行特异性RAPD标记筛选,筛选出1条RAPD随机引物,可扩增出较好的差异条带,并对高亲和性灰飞虱群体能扩增出1条1200bp特异性条带。推测这条特异性条带可能作为灰飞虱与RSV亲和性相关的RAPD标记。     

水稻条纹叶枯病与灰飞虱的防治技术

介绍水稻条纹叶枯病的发病症状、病害循环和灰飞虱的危害特点,提出采用抗性品种为基础、以农业防治为主的生态调控技术为主导、以治虫防病为核心的综合防治策略。     

灰飞虱重发原因及水稻条纹叶枯病控制技术

大丰市常年种植水稻1.4~2.0hm2,近几年水稻条纹叶枯病大发生,造成了水稻不同程度的减产,甚至个别田块毁苗重种。为迅速控制病害发展,2003~2005年笔者开展调查研究和药剂试验,推广应急防治技术,取得了明显成效。1灰飞虱重发原因1.1种植制度、栽培方式有利于灰飞虱生存和发生稻麦     

水稻条纹病毒编码蛋白在灰飞虱体内的检测及其与CP体外结合研究

 【目的】检测灰飞虱体内由水稻条纹病毒（RSV）编码的外壳蛋白（CP）、病害特异性蛋白（SP）,以及非结构蛋白NS2、NS3和NSvc4等5种蛋白以及病毒粒子CP与SP、NS2、NS3、NSvc4的体外结合,为进一步研究水稻条纹病毒与其介体昆虫互作提供有用信息。【方法】提取高带毒灰飞虱（Q家系）总蛋白,用免疫方法检测昆虫体内CP、SP、NS2、NS3和NSvc4等5种重要蛋白的表达以及病毒粒子CP与SP、NS2、NS3、NSvc4的体外结合情况。【结果】结果表明在带毒灰飞虱体内以上5种蛋白都能检测到,而且CP含量最高,NSvc4、SP、NS3、NS2含量依次降低;用体外原核表达后纯化的蛋白进行了RSV粒子CP与SP、NS2、NS3、NSvc4的体外结合实验,实验结果表明病毒粒子CP与SP、NSvc4之间存在体外结合关系。【结论】检测结果为灰飞虱作为RSV的昆虫寄主并且可以在其体内增殖的结论提供了支持,表达差异表明病毒编码蛋白在介体灰飞虱体内可能存在着一定的协调关系;病毒粒子与SP的结合为前人关于CP与SP可能共同作用于叶绿体进而影响症状的严重度的报道又提供了一个新的证据,病毒粒子与NSvc4之间存在体外结合关系,也为NSvc4可能作为运动蛋白通过与CP的互作以及诱导病毒在胞间运动需要CP的辅助提供了佐证。     

利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统（split-ubiquitin yeast membrane system）,以小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）的外壳蛋白（CP）基因为诱饵对异沙叶蝉（Psammotettix alienus L.）cDNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds cDNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到pPR3-N文库载体上,构建得到以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选pPR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology（GO）注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×10⁶ cfu,文库实际扩增数量大于1.3×10⁶ cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉cDNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体pDHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L^-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库,这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库的成功构建与筛选,为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。     

灰飞虱传递水稻条纹病毒研究初报

由灰飞虱(Laodelplar striatellus Fallén)传播的水稻条纹病毒草(Rice strpip tenuivirus,简称RSV)引起的水稻条纹叶枯病是生产一种重要的农作物病毒病,该病最早于20世纪初在日本被发现[1].     

灰飞虱体内Wolbachia的感染与其携带水稻条纹病毒的相关性分析

使用斑点免疫结合试验(DIBA)和PCR法分别对灰飞虱体内水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)和沃尔巴克氏体(Wolbachia)的感染特点进行研究。结果发现:灰飞虱体内广泛存在Wolbachia感染,但是灰飞虱体内Wolbachia的感染与其体内携带RSV的特点不存在明显的相关性,同时二者在经卵传播过程中也没有明显的相关性。这暗示了RSV和Wolbachia在灰飞虱体内虽然都可以垂直传播给下一代,但是二者在传播方式上或者在传播过程中可能是两个相对独立、相互间没有明显影响的过程。     

灰飞虱体内水稻条纹病毒基因的RNA干扰效应

【目的】探讨利用RNA干扰技术切断灰飞虱体内水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）繁殖的可行性,研究RSV病毒不同基因间的互作关系。【方法】利用喂食的方法测定体外合成的dsRNA对灰飞虱体内RSV基因表达的抑制作用。根据RSV基因序列设计并合成3种dsRNA（dsRdRp、dsNSvc4和dsCP）,分别喂食携带RSV病毒的2龄灰飞虱,96 h后利用荧光定量PCR技术同时检测灰飞虱体内RSV病毒不同基因RdRp、NSvc4和CP的表达量。【结果】经过特异性dsRNA喂食处理的灰飞虱体内RSV病毒靶基因NSvc4、CP的表达量大幅下调,下调幅度分别为93.2%和94.9%;靶基因RdRp表达量下调幅度为45.6%。dsRNA喂食处理对其它非靶标RSV基因的表达均具有一定的下调作用,表明RSV病毒不同基因RdRp、NSvc4和CP间可能存在互作关系。【结论】本研究为利用转dsRNA工程微生物或转基因水稻进行RSV病毒的防治提供了重要依据。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

单头灰飞虱体内两种水稻病毒的双重一步法RT PCR检测

灰飞虱传播的水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)是危害我国水稻生产最主要的2种病毒,建立灰飞虱体内RSV和RBSDV快速、可靠的检测方法是水稻生产中的重要问题。本研究根据RSV RNA3和RBSDV S10序列分别设计了2个病毒的特异性引物,通过退火温度和PCR循环数等条件的优化,建立了灰飞虱体内RSV和RBSDV快速鉴定的双重一步法RT PCR体系。对一步法和两步法RT PCR检测结果进行比较,表明2种方法均能准确有效鉴定灰飞虱体内的2种病毒,且两步法的检测效果略好于一步法。而灵敏度实验表明一步法RT PCR可以从0005 ng·μL-1的灰飞虱RNA初始模板中准确检测到病毒,完全满足单头灰飞虱体内病毒检测的需要。应用本研究建立的双重一步法RT PCR体系对200头获毒灰飞虱样品中的RSV和RBSDV进行了检测,结果进一步证实了此方法的稳定性和可靠性。     

吡蚜酮种子处理对灰飞虱和水稻条纹叶枯病的防效

研究了吡蚜酮浸种和拌种处理对灰飞虱的防治效果和水稻条纹叶枯病的控制效果。结果表明,秧田揭膜后5~11 d,25%吡蚜酮WP 200~400倍液浸种处理对灰飞虱成虫的防效在55.70%~74.88%之间;移栽后40 d,对水稻条纹叶枯病株防效在70.50%~72.34%。25%吡蚜酮WP 2~8 g/kg拌种对灰飞虱成虫防效在57.84%~86.30%,对水稻条纹叶枯病株防效在64.51%~75.51%。     

水稻条纹病毒云南分离物病害特异性蛋白基因的分子变异

对采自云南大理、陆良、禄劝、石林、玉溪、保山和宜良等地的水稻条纹叶枯病病样,提取病叶总RNA,经RT-PCR、cDNA克隆和序列测定,获得了水稻条纹病毒(Rice strip virus,RSV)7个云南分离物的SP基因序列,核苷酸长为537 nts,并与GenBank中已报道的RSV SP基因进行同源性比较,综合分析了云南RSV不同分离物SP基因的分子变异.对纤细病毒属6种病毒的SP蛋白氨基酸序列进行进化分析,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,与RGSV亲缘关系最远.     

拟南芥NiNJA基因酵母双杂诱饵载体构建及互作蛋白的筛选

JAZ蛋白是植物茉莉酸信号途径的重要负调控因子,JAZ与NiNJA形成蛋白复合体抑制茉莉酸下游转录因子的转录活性,NiNJA蛋白是联系JAZ蛋白与下游转录因子的重要因子.为了研究NiNJA调控的下游基因,首先构建了NiNJA基因的诱饵载体pGBKT7-NiNJA,然后转化酵母Y2H Gold感受态,通过自转录激活实验,发现诱饵载体pGBKT7-NiNJA没有自转录激活活性.在此基础上,从拟南芥“Mate&PlateTM”Library 进行酵母双杂筛选,获得若干个与NiNJA互作的蛋白,为下一步鉴定NiNJA的互作蛋白及茉莉酸的信号调控途径打下基础.     

水稻条纹病毒云南分离物NS2蛋白基因的分子变异

通过核苷酸测序表明,我国云南的16个RSV分离物,依据NS2蛋白基因同源性,基本按采样年份(2002、2003)分为了2组。结合已报道的日本T、O分离物,构建系统发育树,分析我国云南分离物与日本分离物可能有共同的起源。     

利用酵母双杂交系统筛选感病番茄中蔬四号与无毒蛋白AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白

 【目的】利用酵母双杂交系统在感病番茄中蔬四号中筛选分别与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,研究AvrPto、AvrPtoB作为毒性因子在感病番茄中的作用通路。【方法】提取感病番茄中蔬四号的总RNA,合成中蔬四号cDNA文库,分别构建AvrPto和AvrPtoB的诱饵载体,从中蔬四号cDNA文库中筛选分别与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,并对阳性克隆进行分析和鉴定。【结果】最终筛选到7个与AvrPto互作的蛋白,2个与AvrPtoB互作的蛋白,核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）羧化酶/加氧酶小亚基和AvrPto、AvrPtoB都能够互作,说明AvrPto、AvrPtoB参与破坏植物的光合作用;另外与AvrPto互作的蛋白质还包括叶绿体原卟啉原氧化酶、叶绿体醛缩酶、叶绿体延伸因子TufA、翻译延伸因子等参与植物光合作用蛋白。【结论】分析筛选到的蛋白主要是参与植物光合作用的蛋白,推测AvrPto、AvrPtoB通过与植物光合作用有关的蛋白互作,或者影响卡尔文循环,或者影响叶绿素和相关蛋白质的合成,从而破坏植物光合作用,促进侵袭位点叶肉细胞衰老、死亡,进而引起坏死症状。