盐胁迫下调控小麦苗期性状的QTL分析

【目的】定位盐胁迫下调控小麦苗期性状的QTL位点,为分子标记辅助选择小麦耐盐性状提供基因位点和连锁标记。【方法】以小偃54×京411重组自交系群体为材料,在盐胁迫条件下检测调控小麦苗期MRL、     RDW、SDW和TDW及其相对性状的QTL位点。【结果】共检测到调控小麦苗期4个性状及其相对性状的25个QTL位点,分布在1A、2A、2D、3A、4A、4B、5B、5D、6B、7A和7B共11条染色体上,贡献率在4.4%-25.5%。其中有15个QTL位点成簇分布于3A、4A、4B、5B、5D染色体的5个遗传区间,其余10个QTL位点各自分布于不同的染色体区段。检测到的5个贡献率大于10%的位点分别位于3A染色体的Xgwm497.1-Xcfa2193和4A染色体的Xbarc78-Xgwm350.1。【结论】多数调控小麦耐盐性的QTL位点成簇分布于3A、4A、4B、5B和5D染色体上,3A染色体的Xgwm497.1-Xcfa2193和4A染色体的Xbarc78-Xgwm350.1携带所有5个贡献率在10%以上的QTL位点。     

小麦RPD3/HDA1基因家族的全基因组鉴定及其对热胁迫的响应

RPD3/HDA1是组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)家族中最大的亚族,已知的HDAC家族基因在拟南芥、水稻等植物的生长发育和非生物胁迫方面都发挥着重要作用,但小麦中对HDACs的研究却较少。为探究小麦中 RPD3/HDA1家族基因对热胁迫的响应,本试验利用生物信息学方法,从小麦全基因组中鉴定出36个小麦 RPD3/HDA1基因,并对其基因结构、进化关系、顺式作用元件和热胁迫下的表达模式进行分析。结果表明:除3A和4A外,其余小麦染色体均含有该家族基因,其基因结构中外显子和内含子的数目差异明显。该小麦家族基因在不同组织和不同逆境胁迫中存在差异表达, TaHDAC-Ⅱ-3a、 TaHDAC-Ⅱ-3b和 TaHDAC-Ⅱ-3d在叶片中的表达量明显高于其他组织, TaHDAC-Ⅰ-2d、 TaHDAC-Ⅰ-2a和 TaHDAC-Ⅰ-2b在热胁迫后表达量有明显上调。进一步研究发现,不同基因在同一生育时期的热胁迫下响应不同,同一基因在不同生育时期对热胁迫的响应也不同,并且相对于35℃而言,多数基因对42℃胁迫响应更显著。这些结果对寻找小麦 RPD3/HDA1家族候选耐热基因具有重要的参考价值。     

水稻磷胁迫响应基因OsRCI2-9的克隆及功能鉴定

【目的】分析水稻OsRCI2-9的功能,进而解析其耐低磷胁迫的作用机制,以利于磷高效作物的改良与选育。【方法】通过对比分析水稻磷信号中心调控因子OsPHR2超表达（OsPHR2(O)）与干涉（OsPHR2(Ri)）转基因植株和野生型植株基因芯片数据,发现一个在OsPHR2(O)背景下诱导表达的RCI2家族基因--OsRCI2-9,首先利用实时荧光定量PCR对芯片数据进行验证。然后根据TIGR上的基因序列设计引物,扩增其全长cDNA;进而利用DNAStar来寻找其开放阅读框,并利用TMHMM2.0对蛋白序列的跨膜结构进行预测;在Phytozome中利用BLAST搜索拟南芥和玉米中的同源基因,并将OsRCI2-9与拟南芥RCI2、玉米RCI2家族的蛋白序列利用Clustal X 1.8进行多重序列比对和同源性分析;利用MEGA 5.2.1软件的最大似然法对同源蛋白构建进化树;利用植物顺式作用元件数据库PLACE分析启动子序列中的顺式作用元件;利用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测OsRCI2-9在不同胁迫处理条件下的表达模式;将OsRCI2-9的cDNA序列连入带有CaMV 35S启动子的pCAMBIA1300表达载体中构建其超表达载体并发展转基因材料,对其表型进行分析,并对转基因植株的有效磷进行测定。【结果】OsRCI2-9位于水稻第6染色体上,基因全长237 bp,由2个外显子和1个内含子组成,编码78个氨基酸。OsRCI2-9含有2个跨膜结构域,其在序列上与玉米ZmRCI2-2、ZmRCI2-7和ZmRCI2-8同源性较高;通过启动子序列分析发现OsRCI2-9启动子含有干旱、低温,ABA、细胞分裂素、赤霉素及磷饥饿响应等元件;RT-PCR和实时荧光定量PCR发现OsRCI2-9受到缺磷处理的强烈诱导,在根中OsRCI2-9还受到缺钾和缺铁的少量诱导及缺氮的微量抑制。进一步研究发现在正常磷浓度下,OsRCI2-9超表达转基因植株与野生型相比,表现为生长缓慢,分蘖数减少,而在低磷条件下,表型与野生型差别不大。通过测定有效磷含量发现OsRCI2-9超表达转基因植株在正常磷浓度与缺磷条件下较野生型植株有效磷含量均有明显的提高。【结论】OsRCI2-9参于了植物体内磷平衡调控。     

茶树胆碱单加氧酶CsCMO的克隆及甜菜碱合成关键基因的表达分析

【目的】从茶树中克隆甜菜碱（GB）合成途径中的关键酶——胆碱单加氧酶CsCMO,研究不同逆境胁迫和不同抗寒茶树品种间GB合成中关键基因的表达模式,并分析茶树体内GB的含量,为茶树抗性育种奠定基础。【方法】采用反转录PCR结合RACE技术,从茶树中克隆CsCMO的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,结合前期克隆得到的茶树甜菜碱醛脱氢酶CsBADH,用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析这2个基因的表达模式,紫外分光光度计测定GB含量。【结果】克隆得到茶树CsCMO（GenBank登录号：JX050146）的cDNA全长1 558 bp,包含1 305 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码434个氨基酸,并被定位在叶绿体上。氨基酸序列分析表明,CsCMO含有CMO中保守的Rieske型2Fe-2S结构域和单分子非血红素Fe结合位点,与其它植物CMO序列相似性在50%以上;进化树分析显示,它与枸杞的关系最近。qRT-PCR分析表明,4℃低温、NaCl盐和ABA处理均能诱导CsCMO和CsBADH表达,96 h内随着处理时间的增加,表达量呈增加趋势,但2个基因的表达模式有差异,盐胁迫诱导基因表达更显著;在不同抗寒品种中,2个基因的表达在抗性强的品种中表达量总体要高于抗性弱的品种,且CsBADH的变化比CsCMO的显著。3种胁迫处理48 h后,叶片中的GB含量均增加;低温处理后抗寒性强的品种中GB含量比抗寒性弱的高。【结论】克隆了茶树CsCMO,在低温、NaCl盐以及ABA处理下,GB积累,CsBADH和CsCMO上调表达,且盐胁迫下的表达更明显,表明GB与茶树抵御这3种胁迫关系密切。     

小麦耐盐相关基因TaRSTR的克隆与功能分析

高盐是限制植物生长和发育的重要非生物胁迫因子。以耐盐小麦RH8706-49根部基因表达谱芯片结果为基础,利用电子克隆和RT-PCR方法克隆了一个盐胁迫时上调表达的基因,命名为TaRSTR(登录号:EU263918)。荧光定量PCR分析证实该基因受盐胁迫诱导表达,亚细胞定位结果显示TaRSTR蛋白定位在细胞核里。TaRSTR过表达提高了转基因拟南芥在盐胁迫下的种子萌发率及成年植株的耐受性。TaRSTR基因过表达可显著提高已知耐盐相关基因At FRY1、At P5CS1和AtRD29B的表达量,推测TaRSTR基因通过这些标记基因提高了转基因拟南芥的耐盐性。上述结果表明TaRSTR基因过表达能提高植株的耐盐性,是植物耐盐的正调节子。     

小麦K2型脱水蛋白DHN14响应非生物胁迫的功能分析

【目的】研究脱水蛋白DHN14的功能及其在植物响应非生物胁迫中的潜在作用。【方法】从小麦品种"郑引1号"克隆获得脱水蛋白基因DHN14,对其进行生物信息学分析,利用实时定量PCR分析该基因在逆境胁迫下的表达水平,构建脱水蛋白DHN14基因的原核表达载体(重组菌pET28a-DHN14),经IPTG诱导表达后,在非生物胁迫下,研究该蛋白对大肠杆菌及乳酸脱氢酶(LDH)的保护作用。【结果】克隆获得脱水蛋白基因DHN14的CDS为339 bp,编码112个氨基酸,该蛋白含有2个保守的K片段,属于高亲水性无序蛋白,其分子质量为24 ku,等电点(pI)约为6.28;多序列比对分析表明,DHN14蛋白与WCOR726(Triticum aestivum)脱水蛋白的亲缘关系最近;实时定量RT-PCR结果表明,脱水蛋白基因DHN14受干旱、低温和ABA诱导表达;在20 mmol/L金属离子(Co~(2+)、Ni~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+))胁迫下,表达DHN14重组蛋白的大肠杆菌的活力明显高于对照,表明该蛋白在大肠杆菌中对金属离子胁迫具有保护作用;用1.0 mmol/L过氧化氢进行胁迫处理,重组菌DHN14存活率显著增高,说明脱水蛋白DHN14能够提高大肠杆菌对过氧化氢胁迫的耐受性;在低温和脱水胁迫下,DHN14脱水蛋白对乳酸脱氢酶的活性具有保护作用。【结论】小麦脱水蛋白DHN14能够响应非生物胁迫,提高对低温、干旱、金属离子、过氧化氢的耐受性。     

红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)的克隆及盐胁迫下表达分析

[目的]克隆红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)并分析其组织表达特性及不同盐胁迫下的表达模式,为深入研究HcGR基因在响应盐胁迫的分子调控机制提供理论参考.[方法]基于红麻转录组测序结果,克隆HcGR基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测HcGR基因在红麻不同组织及不同盐度胁迫[CK(0 mmol/L NaCl)、T1(50 mmol/L NaCl)、T2(100 mmol/L NaCl)和T3(200 mmol/L NaCl)]下的表达情况.[结果]克隆获得的HcGR基因开放阅读(ORF)长度为1698 bp,其编码蛋白相对分子量为60 kD,由555个氨基酸残基组成,理论等电点(pI)为8.46,为亲水性蛋白,定位于叶绿体;HcGR蛋白二级结构以无规则卷曲为主,以α-螺旋、延伸链和β-转角为辅,所占比例分别为44.14%、27.75%、22.16%和5.95%,其三级结构由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链3种结构元件相互盘绕而成;该蛋白与榴莲GR蛋白亲缘关系较近.HcGR基因在红麻根、茎和叶中均有表达,且相对表达量存在显著差异(P<0.05,下同),相对表达量排序为叶>根>茎,表明HcGR基因具有明显的组织表达特异性.在红麻的根和叶中,HcGR基因相对表达量随NaCl胁迫浓度增加整体上呈先升高后降低的变化趋势,且均在T1处理下达峰值,显著高于CK、T2和T3处理.HcGR基因在茎中的相对表达量随NaCl胁迫浓度增加呈波动变化趋势,但T1、T2和T3处理均高于CK,其中T1和T3处理显著高于CK.[结论]HcGR基因在红麻根、茎和叶中的表达具有明显组织特异性,且可被不同浓度NaCl诱导响应盐胁迫信号,并通过上调各组织中的转录水平以提高抗盐胁迫能力,故推测该基因在红麻抗盐胁迫机制中发挥重要调控作用.     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS2,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号:GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号:GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

响应低磷胁迫的小麦MDP激酶基因TaMPK1a-1的克隆和表达分析

 【目的】蛋白磷酸化在介导非生物逆境信号的转导中具有重要作用。以笔者在低磷胁迫下鉴定的小麦促分裂原活化蛋白激酶（MAP激酶）基因TaMPK1a-1为基础,开展该基因应答低磷逆境分子特征的研究。【方法】利用cDNA-AFLP技术,鉴定特异上调表达的MAP激酶基因TaMPK1a-1。采用生物信息学技术研究基因结构和编码蛋白特征,采用半定量RT-PCR技术研究TaMPK1a-1应答低磷胁迫逆境的分子特征。【结果】TaMPK1a-1 cDNA长度为2 170 bp,开放阅读框为1 737 bp,编码578个氨基酸残基。TaMPK1a-1含有2个参与双重磷酸化作用的TEY和TDY基序。在正常供磷条件下,磷高效品种石新828和磷低效品种冀7369根叶中均检测不到TaMPK1a-1的转录本;低磷处理下,TaMPK1a-1的表达在上述品种的根叶中均受到明显诱导。与冀7369相比,低磷条件下石新828根叶中TaMPK1a-1的转录本明显增多。【结论】TaMPK1a-1级联转导途径不仅影响着小麦对低磷信号的响应,而且对于增强小麦适应低磷胁迫的能力中也可能具有重要作用。     

NaCl胁迫对不同小麦品种萌发与幼苗生长的影响

为研究NaCl胁迫对不同小麦(Triticum aestivum L.)品种萌发与幼苗生长的影响,以周麦18、百农207、华育198、矮抗58和百农69为材料,对不同浓度NaCl溶液胁迫下小麦发芽势、发芽率、根长和苗高等耐盐指标进行分析。结果表明,随着NaCl溶液浓度的升高,小麦的发芽势、发芽率、根长和苗高的相对值均明显下降,不同品种间及浓度间均有明显变化;综合5个试验品种的表现可知,百农207和周麦18在苗期表现出较强的耐盐能力,矮抗58、百农69和华育198的耐盐能力依次降低。     

不同小麦品系的抗盐性鉴定

以5个小麦(Triticum aestivum L.)品系"35"、"4399"、"5229"、"7228"、"0628"为材料,以蒸馏水培养为对照,室内模拟盐胁迫条件对不同品系的种子发芽率、盐害指数及叶片中丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)活力进行测定。结果表明,盐胁迫下5个品系的发芽率均表现出不同程度的差异,结合MDA含量和POD活力参数得出5个小麦品系中"4399"抗盐性最好,"7228"、"35"和"0628"次之,品系"5229"抗盐性最差。     

纤维素酶/木聚糖酶产生菌株的筛选及其降解小麦秸秆的研究

从自然环境中筛选出1株可同时分泌纤维素酶和木聚糖酶的菌株,并对其降解小麦(Triticum aestivum L.)秸秆的特性进行分析。结果表明,ZH-19菌株可同时高产纤维素酶和木聚糖酶。经形态特征和ITS保守区测序分析确定该菌株为Penicillium thiersii。菌株降解小麦秸秆的过程中,纤维素酶活和木聚糖酶酶活分别在第6天和第7.5天达到其最大值,分别为145.54、93.20 U/m L;纤维素比半纤维素降解的速率要快,表明在小麦秸杆降解过程中,可能需要纤维素酶、半纤维素酶的协同作用,才能实现对木质纤维素的最大降解。     

小麦TaLTR基因的克隆及初步表达分析

以小麦山融3号为试验材料,克隆了TaLTR cDNA序列(Low temperature-responsive RNA-bind-ing protein)。序列分析表明,TaLTR序列包含完整的ORF区,编码蛋白含有162个氨基酸,其氨基端包含一个RRM(RNA recognition domain)超家族保守的结构域,羧基端则富含甘氨酸;经半定量RT-PCR分析,表明TaLTR参与低温、干旱、盐胁迫逆境反应。     

小麦亲本及其杂交后代苗期氮代谢相关指标的遗传与表达差异

【目的】分析小麦氮代谢相关指标的遗传与表达差异,为选育小麦氮高效品种提供理论依据。【方法】选用6个不同氮效率小麦品种及其组配的3个杂交组合,采用霍格兰营养液进行苗期试验,设置3个氮水平：低氮（LN）、正常供氮（CK）、高氮（HN）,分别为0.2、4和8 mmol•L-1,在3个氮水平下对小麦苗期形态、氮代谢相关酶、氮含量和氮素积累量进行遗传分析,同时探讨了根叶的氮代谢相关基因的表达量差异。【结果】根长和根鲜重在低氮水平下明显高于正常供氮,杂种优势表现为负向。苗高和苗鲜重随着氮水平的增加呈抛物线增长趋势,杂种优势表现为超中亲甚至超高亲。根长随氮水平增加先大幅降低后趋于平缓,而苗高则先大幅下降后趋于平缓。根苗鲜重变化规律与根长和苗高一致。根含氮量随着氮水平增加呈上升趋势,而叶片含氮量和氮素积累量则先大幅升高后小幅下降,高氮水平下根叶含氮量杂种优势显著。硝酸还原酶活性和谷氨酰胺合成酶活性均随着氮水平升高而升高,硝酸还原酶活性的杂种优势均为负向,而谷氨酰胺合成酶活性表现为正向杂种优势。硝酸还原酶活性的杂种优势变化与根系性状基本一致,谷氨酰胺合成酶活性杂种优势与地上部幼苗性状基本一致。根系硝酸转运蛋白的3个基因的表达量趋势一致,均随着氮水平升高呈先大幅下降后趋于平缓,且杂种优势整体表现为正向。叶片NRT1.1和GS1c的表达量均随着氮水平增加呈先大幅上升后小幅下降趋势,杂种优势整体表现为正向。小麦根系与叶片NRT1.1的表达变化趋势不一致,根系NRT1.1的表达量在氮胁迫时大幅升高,而叶片NRT1.1的表达量在氮胁迫时大幅下降。综合所测15项指标结果显示,在低氮水平下低氮高效品种YM35和高氮水平下高氮高效品种DK138多数指标较高。组合YM35×DK138是由低氮高效品种和高氮高效品种杂交而成,该组合在低氮水平15项指标中有10项指标较高,且在正常供氮和高氮水平下有6项和5项指标较高。【结论】与氮素吸收密切相关的根系指标随着氮水平增加先大幅下降后趋于平缓。与氮素利用相关的指标和基因表达随着氮水平增加先大幅增加后趋于平缓。3个组合在不同氮水平下大多数指标表现为正向杂种优势。以低氮高效和高氮高效品种作亲本组配利于在低氮环境下对优良后代的选择,以氮高效品种作亲本有利于后代在正常供氮时的生长。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

小麦转录因子TabHLH041基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从小麦品种辽春10号中克隆得到1个b HLH转录因子基因Tab HLH041,并对其表达特性进行分析,以期为研究b HLH转录因子在小麦发育中的功能奠定基础。结果表明,Tab HLH041c DNA开放阅读框(ORF)长1 179 bp,编码392个氨基酸,Tab HLH041蛋白在C端含有1个b HLH结构域;该基因包括4个外显子和3个内含子。系统发育分析发现,Tab HLH041蛋白与大麦b HLH蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,总体上该基因的表达具有昼夜节律性,在光照条件下表达量呈下降趋势,在黑暗条件下表达量呈上升趋势。在低温条件下,Tab HLH041基因的表达呈现前期被诱导、后期被抑制的特征,处理24 h时低温的抑制作用最明显;在高盐、外源ABA和干旱处理条件下,Tab HLH041基因的表达持续受到抑制。综上,Tab HLH041基因可能参与光周期及逆境胁迫的信号转导途径。