王台产卵育王技术对西方蜜蜂蜂王质量的影响

【目的】蜜蜂蜂王的质量是影响蜂群生产的首要因素。旨在探究蜜蜂王台产卵育王技术培育蜂王的质量（生产力和免疫能力等），以期为如何提高蜂王质量和促进蜂群生产提供新思路。【方法】以西方蜜蜂（Apis mellifera）为试验对象，控制F1蜂王在王台产卵育王器中直接产卵，待产卵后转移至育王条，并放入继箱育王区中进行培育F2蜂王，为培育王台产卵组F2蜂王；对照组为人工移虫育王方式，即利用移虫针移取2日龄工蜂巢房幼虫至王台进行育王，培育对照组F2蜂王。通过测定分析F2蜂王个体形态、卵巢数量，以及分析两种育王方式培育F2蜂王Jhamt,Hex110,Defensin1和CYP9Q1 4种基因的相对表达丰度，以科学评估培育蜂王质量水平。【结果】王台产卵组蜂王接受率显著低于对照组（P<0.05），但王台产卵组蜂王的初生重、前翅长与后翅长均显著高于对照组蜂王（P<0.05）；王台产卵组蜂王的右侧卵巢管数也显著高于对照组（P<0.05）;3个与蜂王发育和免疫相关基因（Jhamt,Hex110,Defensin1）在王台产卵组蜂王体内的表达量显著高于对照组蜂王，而与解毒相关的蜂王发育和免疫相...     

蜜蜂蜂王与雄蜂幼虫饥饿信息素鉴定及其生物合成通路

【目的】蜜蜂幼虫在饥饿状态下会通过释放特定信息素来向外界传递饥饿信号,称为蜜蜂幼虫饥饿信息素(hunger pheromone)。论文旨在研究西方蜜蜂(Apis mellifera)蜂王与雄蜂幼虫饥饿信息素化学成分及在幼虫体内的生物合成通路,明确蜜蜂幼虫与成年蜂之间的化学信息素交流机制。【方法】采集2日龄与4日龄西方蜜蜂蜂王与雄蜂幼虫及其食物,将其分为饥饿组、饲喂组与纯食物组。饲喂组幼虫平躺在预先准备好的食物表面,饥饿处理组则不提供食物。所有样品分别放入20 m L密封采样瓶中并在35℃条件下放置45 min。利用Needle trap技术从样品瓶中采集10 m L气体,富集气体中的挥发性化学物质。在气质联用进样口以250℃高温将富集的化学物质解离,并通过气质联用技术分析鉴定蜂王与雄蜂幼虫饥饿信息素。同时,采用RNA-Seq技术分析饥饿信息素在蜂王与雄蜂幼虫体内的生物合成通路及相关基因表达。【结果】从蜂王与雄蜂幼虫中分别分析鉴定出10种与9种信息素,其中蜂王幼虫含有一种特有的幼虫信息素——2-庚酮,且在蜂王食物中含量最高。E-β-罗勒烯在蜂王与雄蜂幼虫各饥饿组含量均显著高于其饲喂幼虫组与食物组,表明蜂王与雄蜂幼虫均以E-β-罗勒烯为其饥饿信息素。2日龄蜂王与雄蜂幼虫饥饿组E-β-罗勒烯含量均差异不显著,但4日龄蜂王幼虫饥饿组E-β-罗勒烯含量显著低于雄蜂幼虫组。其余8种信息素为肉豆蔻酸、棕榈酸、甲基棕榈酸脂、硬脂酸、棕榈油酸、十五烷酸、乙酸与乙酸乙酯,均未出现饥饿组高于其他两组的规律。其中乙酸乙酯与乙酸在食物组与饲喂组含量高于饥饿组,推测其可能来自于幼虫食物。RNA-Seq结果表明蜂王与雄蜂幼虫通过甲羟戊酸途径由乙酰辅酶A从头合成E-β-罗勒烯。发现Geranylgeranyl pyrophosphate synthase-like与Farnesyl pyrophosphate synthase等9个基因参与该通路,但在饥饿组与其饲喂组幼虫中表达差异均不显著。【结论】蜜蜂蜂王与雄蜂幼虫利用E-β-罗勒烯作为其饥饿信息素乞求食物,并且在体内从头合成E-β-罗勒烯。工蜂利用2-庚酮标记蜂王幼虫,但未对雄蜂幼虫进行标记。     

应用微卫星DNA技术研究中华蜜蜂群内工蜂监督效果

【目的】研究不同中华蜜蜂（Apis cerana cerana）群内的工蜂繁殖现象,探讨蜂群的工蜂监督效果。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,对处女蜂王分别进行单雄和双雄人工授精,并以蜂王自然交尾的蜂群作为对照。蜂王成功繁殖后7周,利用蜜蜂微卫星DNA技术检测蜂群内的雄蜂是由蜂王产的未受精卵发育而成,还是由工蜂产的未受精卵发育而成。【结果】所有蜂群中的雄蜂都是由蜂王产的未受精卵发育而成。【结论】在人工授精和自然交尾蜂群中都明显存在工蜂监督行为。     

中华蜜蜂工蜂监督及卵表面超微结构研究

为研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana)的工蜂监督机制,采用人工移取中华蜜蜂蜂王产的受精卵(QDG)、未受精卵(QHG)和工蜂产的未受精卵(WHG)至同一张巢脾的工蜂巢房和雄蜂巢房中,置于中华蜜蜂的有王群中,在2,5,12和24 h分别观察3种类型卵的清除率。同时利用电子扫描显微镜观察中华蜜蜂QDG、QHG和WHG三种类型卵在2,5,12和24 h的表面超微结构。结果表明:在2,5,12和24 h WHG的清除率都显著比QDG和QHG高(P0.05),QDG和QHG之间均差异不显著(P0.05),中华蜜蜂蜂群中存在工蜂监督现象;在2,5,12和24 h QDG、QHG和WHG 3种类型卵表面超微结构无显著差异。     

蜂王浆对雌性蜜蜂幼虫dynactin p62甲基化影响

【目的】研究蜂王浆对雌性蜜蜂幼虫dynactin p62甲基化水平影响。【方法】以意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）和中华蜜蜂（A. cerana cerana）1日龄幼虫为试验材料,分别饲喂意大利蜜蜂蜂王浆和中华蜜蜂蜂王浆,并提取每组3日龄和6日龄幼虫样品的基因组DNA,利用Sequenom MassARRAY技术检测dynactin p62甲基化水平。【结果】饲喂异种蜂王浆可以更显著降低雌性蜜蜂幼虫dynactin p62整体甲基化水平;饲喂同一种蜂王浆,均为6日龄幼虫dynactin p62整体甲基化水平显著低于3日龄;2种蜂王浆对雌性蜜蜂幼虫dynactin p62各位点甲基化水平影响不同。【结论】2种蜂王浆对雌性蜜蜂幼虫dynactin p62整体甲基化水平和各位点甲基化水平影响不同,这说明不同蜂王浆具有不同的生物学效应。     

巢脾使用时间对中华蜜蜂蜂群生长及工蜂形态特征的影响

【目的】为了解随着巢脾使用时间的增加,巢脾结构的变化对中华蜜蜂蜂群生长及工蜂形态特征的影响。【方法】以云贵高原中华蜜蜂(生态型之一)连续使用不同时间(20 d、半年、1年和2年)的巢脾及巢脾培育的出房工蜂为试验材料,观测巢脾颜色和结构、蜂群生长及工蜂形态特征等指标。【结果】随着使用时间的增加,巢脾颜色逐渐变深,子脾区域巢脾厚度和巢房深度逐渐增加,但巢房内围边长、内围直径和容积逐渐减小。巢脾结构的变化导致培育的蜂子数量、子脾面积和出房工蜂形态指标均极显著减小(P0.01)。【结论】中华蜜蜂蜂群生长状况及工蜂形态特征均受巢脾的使用时间及其结构变化影响,新巢脾对蜂群培育蜂子效果较好。因此,在科学饲养中华蜜蜂时,蜂农应及时促蜂造脾,并在巢脾使用半年后进行淘汰换新,这对制定合理的中华蜜蜂饲养管理方案和提高蜂群生产性能有重要的意义。     

蜜蜂复眼颜色的遗传

在卡蜂的一个品系中发现了白眼突变的雄蜂。用产白眼雄蜂的蜂王作母本,培育处女王,用本群白眼雄蜂的精液给该处女王进行人工授精。该人工授精王产的雄蜂和工蜂各有50％的白眼突变体。用该人工授精王产的二倍体幼虫培育出了白眼处女王。白复眼处女王产的雄蜂全部为白眼雄蜂,说明蜜蜂复眼的颜色是一对基因控制,白眼工蜂和雄蜂似乎没有视力,出巢后不能返回蜂巢。     

蜜蜂免移虫技术研究与应用

【目的】在养蜂生产中,养蜂者进行蜂王浆生产和人工培育蜂王时,都需要人工移虫。人工移虫对养蜂者视力和熟练程度有较高要求,特别是随着我国劳动力成本的上升和养蜂者老龄化,人工移虫是养蜂生产亟需解决的一个技术瓶颈。在国家蜂产业技术体系连续十年资助下,笔者团队一直在从事蜜蜂免移虫技术研究工作,旨在解决人工移虫问题,为蜜蜂科学饲养提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂生物学特性和仿生学原理,设计一种食品级塑料空心工蜂巢础,在空心巢房位置设计有与其对接的托虫器(或单个托虫器)。当空心巢础造好巢脾后,让蜂王在巢脾上产卵,取出托虫器(或单个托虫器)并安装在底座带孔的王台上,即可进行蜂王浆生产(或育王)。利用改进设计后的第10代免移虫蜂王产卵器,以意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)为试验材料,检验第10代蜜蜂免移虫技术在蜂王浆生产和人工培育蜂王中的可行性。首先利用有分蜂热蜂群紧缩巢脾,让工蜂造好10—12张人工塑料空心巢础脾,再进行免移虫产浆和免移虫育王试验。免移虫产浆试验主要测定单王群、双王群、多王群(4只蜂王)的产卵率,以及产浆时王台接受率;免移虫育王试验采用单王群产卵6 h,同时以人工移虫育王为对照,比较免移虫以卵育王和人工移虫育王两种方法培育的蜂王初生重和卵巢管数差异。【结果】工蜂能在人工塑料空心工蜂巢础上造好完整的巢脾,同时蜂王可在造好的巢脾上产卵。单王群产卵、双王群产卵、多王群(4只蜂王)产卵的产卵率分别为91.24%、92.45%和91.29%,产浆时王台接受率分别为91.12%、92.63%和90.19%,三者均不存在显著性差异(P0.05);免移虫以卵育王和人工移虫育王两种方法培育的蜂王初生重分别为(256.31±3.75)mg和(243.43±2.05)mg,单侧卵巢管数分别为(163.87±9.40)条和(154.77±6.74)条,两者均存在显著性差异(P0.05)。【结论】本研究改进设计的第10代免移虫蜂王产卵器,可以进行免移虫蜂王浆生产和免移虫以卵育王,值得在养蜂生产中推广应用。     

应用蜜蜂营养杂交技术培育抗螨蜂种

 【目的】大蜂螨是中国饲养的西方蜜蜂最重要病虫害之一,多年来药物防治蜂螨,一方面蜜蜂对药物产生了很强的抗药性,另一方面治螨药物在一定程度上会污染蜂产品。本研究通过蜜蜂营养杂交,探讨培育抗螨蜂种的可行性。【方法】采用中华蜜蜂的蜂王浆饲喂意大利蜜蜂工蜂小幼虫,然后测定营养杂交后代工蜂形态指标、苹果酸脱氢酶Ⅱ的基因型频率和基因频率、蜂群遗传相似系数以及抗螨力。【结果】营养杂交子后代工蜂的吻长、右前翅面积、腹部第3+4背板总长、第4背板突间距、第6腹节面积、蜡镜面积6个指标与亲本工蜂之间存在显著差异,但肘脉指数、跗节指数和翅钩数与亲本差异不显著;营养杂交子后代工蜂的苹果酸脱氢酶Ⅱ基因型频率和基因频率存在一定的变异;营养杂交子后代之间遗传相似系数明显高于亲本意大利蜜蜂;营养杂交子后代的工蜂抗螨力显著高于亲本意大利蜜蜂。【结论】通过蜜蜂营养杂交,可以改变营养杂交后代工蜂形态、生理生化、分子遗传相似性及抗螨力等特性。蜜蜂营养杂交可成为蜜蜂育种一条新途径。     

蜂王浆增产措施

蜂王浆是工蜂咽下腺和上颚腺分泌的乳状物质,是工蜂和雄蜂3日龄以内幼虫、蜂王整个幼虫期和生存期的食物。蜂王浆含有多种人体所需要的成分,是一种天然的滋补营养保健品。     

气味受体基因Orco在中华蜜蜂雄蜂触角中的表达及定位分析

【目的】昆虫气味受体（odorant receptors, Ors）在其发挥嗅觉识别过程中采用的是配体门控离子通道信号传导机制,这一离子通道是由一个特定的共受体与一个普通气味受体结合为异源二聚体而形成的。其中,气味共受体（odorant receptor coreceptor, Orco）是一个十分独特的家族,在不同种类昆虫中高度保守,并在调控昆虫的嗅觉行为方面发挥关键作用。论文在对中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）工蜂Orco研究基础之上,进一步探讨雄蜂Orco的表达特性。【方法】采集中蜂1日龄雄蜂的触角、头（去除触角）、胸、腹、足5部分组织,以及不同发育阶段的幼虫、蛹及成蜂触角。提取各样本的总RNA,利用real-time quantitative PCR（qPCR）技术鉴定Orco在雄蜂不同组织及不同发育时期的表达谱;采集1日龄雄蜂触角制备冰冻切片,合成地高辛标记的寡核苷酸探针,利用原位杂交技术对Orco在雄蜂触角中的表达进行细胞定位分析。【结果】qPCR分析结果表明,Orco转录本在不同组织中的表达量表现为触角>头>足>腹>胸,其中触角表达量约为头部的100倍;Orco在雄蜂不同发育阶段均有表达,其中幼虫期和蛹期表达量较低,羽化后开始逐渐升高,性成熟后维持在一个较高的水平。此外,结合前期工蜂荧光定量试验数据,分析得到Orco在雄蜂触角中的表达量极显著高于工蜂触角表达量（P＜0.01）。原位杂交结果显示,Orco阳性杂交信号大量表达于雄蜂触角的板型感器和毛型感器的神经元细胞中。【结论】气味受体基因Orco在中蜂雄蜂的触角中大量表达,且在性成熟后表达量达到高峰。结合前期研究结果,推测Orco在中蜂中是偏雄性表达的。     

免移虫育王和两种酯类幼虫信息素对中华蜜蜂蜂王质量的影响

【目的】比较中华蜜蜂(Apis cerana cerana)免移虫育王和人工移虫育王培育的蜂王质量,明确幼虫信息素中的甲基棕榈酸酯（methyl palmitate,MP）和甲基亚油酸酯（methyl linoleate,ML）在育王过程中能否提高蜂王质量。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,选择蜂群群势、蜂王年龄、子脾面积等基本一致的健康蜂群3群作为哺育群,群势均为5框,采用郎氏标准蜂箱饲养。另选择一群健康、蜂王产卵性能好的蜂群作为母群。免移虫育王和人工育王的比较过程中,每个哺育群中每种育王方式至少育王3次。幼虫信息素试验过程中,每个哺育群每种信息素至少采用人工育王法育王3次。试验期间,对蜂群进行奖励饲喂,提高工蜂哺育积极性。利用自主研制的塑料免移虫育王生产器进行免移虫育王,人工移虫育王则采用自制的蜡质王台。测定育王过程中的幼虫接受率和蜂王出房率,待蜂王出房后测定蜂王初生重、胸重、胸宽,将蜂王的单侧卵巢制成石蜡切片进行卵巢管计数,并采用荧光定量PCR测定蜂王腹部的卵黄原蛋白基因（Vitellogenin,Vg）和转铁蛋白基因（Transferrin,Trf）表达量,从而比较蜂王的质量。为了研究中蜂幼虫信息素中MP和ML在人工育王中使用能否提高蜂王的质量,采用人工移虫育王,在幼虫60—63 h的王台内分别注射1 µL MP和ML（浓度梯度为0、0.1%、1.0%、10.0%）,同样测定蜂王初生重、胸重、胸宽和卵巢管数以及其腹部Vg和Trf表达量等指标。【结果】免移虫育王的幼虫接受率为40.87%,蜂王出房率38.52%;人工移虫育王的幼虫接受率为74.38%,蜂王出房率69.13%。显然工蜂对于人工移虫育王中的蜡质王台更易于接受。免移虫育王培育的蜂王在初生重、胸重、胸宽、单侧卵巢管数和Trf表达量等与人工移虫育王的比较均差异不显著（P＞0.05）,平均值也较接近,但蜂王腹部Vg表达量显著高于人工移虫育王（P＜0.05）。在人工移虫育王蜂王幼虫60—63 h时加入MP（或ML）,不同浓度的MP对蜂王的各项指标均无显著影响（P＞0.05）;0.1% ML对蜂王质量也无显著影响（P＞0.05）;1.0% ML显著降低蜂王初生重、胸重及其腹部Vg的表达（P＜0.05）,对卵巢管数量无显著影响（P＞0.05）;10.0% ML显著降低蜂王的各项指标（P＜0.05）。MP和ML对蜂王Trf表达量均无显著影响（P＞0.05）。【结论】免移虫育王与人工移虫育王相比,王台接受率显著偏低（P＜0.05）,蜂王腹部的Vg表达量增加,但在蜂王初生重、胸部指标、单侧卵巢管数量及Trf表达量方面均无显著差异（P＞0.05）。MP和ML在人工移虫育王过程中的应用并不能达到提高蜂王质量的作用。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差异比较

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)体内抗寒系统的组成,为探究中蜂和意蜂耐寒性能的差异提供理论依据。【方法】试验选取室外相同环境条件越冬的中蜂和意蜂各5群,于2015年12月20日每群随机选取蜜蜂立即测定两者的过冷却点、冰点,比较其耐寒性能差异。然后分别测定蜂体游离水、结合水、脂肪、糖原和蛋白质含量以及海藻糖酶的活性。利用高效液相色谱测定血淋巴中山梨醇、海藻糖、甘露醇的含量。在海藻糖的生物合成通路中确定4个重要调控基因,选择β-action和β-肌动蛋白分别作为中蜂和意蜂的内参基因,采用实时荧光定量PCR检测中蜂和意蜂海藻糖4个相关调控基因在越冬期时m RNA相对表达量的差异。【结果】越冬期中蜂和意蜂过冷却点差异显著,中蜂的过冷却点显著低于意蜂(P0.05),但二者冰点没有显著性差异(P0.05);越冬期中蜂和意蜂蜂体含水量存在显著差异,中蜂体内游离水含量显著低于意蜂(P0.05),而结合水含量显著高于意蜂(P0.05);越冬中期蜂体脂肪含量在两蜂种间差异不显著(P0.05);中蜂和意蜂蜂体和血淋巴蛋白质含量差异不显著(P0.05);意蜂在越冬期时体内糖原含量明显低于中蜂,并且差异显著(P0.05);中蜂血淋巴中甘露醇、山梨醇含量接近于意蜂的两倍,海藻糖含量也相对高于意蜂,差异显著(P0.05);中蜂蜂体和血淋巴的海藻糖酶活性均显著低于意蜂(P0.05);以中蜂为对照组,实时荧光定量PCR检测意蜂的海藻糖酶基因(Tre-2)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)表达量明显高于中蜂(P0.05);而基因Tre-1表达情况相反;海藻糖合成酶基因(TPS)表达量在中蜂和意蜂体内无显著差异(P0.05)。【结论】与意蜂相比,中蜂能够通过降低体内游离水含量,提高糖原和小分子糖含量,调节海藻糖酶活性和相关基因表达等方式降低体内过冷却点,提高自身耐寒性能。     

中华蜜蜂幼虫肠道参考转录组的de novo组装及SSR分子标记鉴定

【目的】利用RNA seq技术对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫肠道参考转录组进行de novo组装,并进行功能及代谢通路注释,进而利用该转录组数据进行中蜂幼虫的SSR分子标记鉴定。【方法】实验室条件下饲养中蜂幼虫,将纯化的蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)孢子饲喂3日龄幼虫,剖取4、5和6日龄幼虫肠道,液氮速冻。将健康幼虫肠道与感染球囊菌的幼虫肠道同时进行Illumina测序。通过对raw reads的过滤得到clean reads,利用Trinity软件组装得到unigenes。通过BLASTx(E-value10-5)比对NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库,对unigenes进行功能和代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计特异性SSR引物,通过常规PCR对来源于北京、辽宁兴城和四川成都的中蜂幼虫肠道样本进行SSR位点鉴定。【结果】中蜂幼虫肠道的RNA seq共得到35 670 000条reads,de novo组装得到43 557个unigenes,平均长度为898 nt。共有18 225个unigenes可被注释到上述公共蛋白数据库,单独注释到NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库的unigenes数分别为3 899、443、37和10个。KOG注释结果显示,11 442条unigenes分布于25个基因家族,其中注释到RNA加工和修饰家族的基因数最多,达1 249个。9 679个unigenes的GO分类结果显示,在生物学进程分类中,注释到细胞进程的基因最多,达4 201个,在分子功能和细胞组分类中,注释到结合与细胞的基因数最多,分别为4 935和2 900个。4 517个unigenes可注释到KEGG数据库中的216个代谢通路,注释到核糖体的基因数最多,达385个。利用MISA软件,可在7 763个unigenes搜索到13 448个SSR位点,随机选取20对SSR引物对国内3个不同来源的中蜂幼虫肠道样本的SSR位点进行扩增,有6对引物可鉴定出SSR分子标记。【结论】成功组装并注释了中蜂幼虫肠道参考转录组,可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息,也可用于补充、丰富和检验东方蜜蜂的参考基因组,基于此转录组数据开发出6个中蜂的SSR分子标记,可应用于中蜂的基因图谱构建、基因多样性分析、基因定位等研究,也说明利用转录组数据开发非模式生物SSRs的方法可行。     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。     

中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞定位

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)重组化学感受蛋白CSP1与不同化学信息素的结合功能、模式及其亚细胞定位,明确触角特异表达的CSP1蛋白功能。【方法】将克隆的中蜂CSP1构建至p ET-32a(+)载体并转入BL21(DE3)感受态细菌中,挑取单克隆菌落接种于LB培养基,培养过夜后按1%(V/V)进行转接,继续培养至OD600≈0.4左右时,加入IPTG至终浓度为1 mmol·L~(-1)后继续诱导5 h。将诱导好的CSP1大肠杆菌菌液离心弃上清,再加入细菌裂解液超声破碎,离心后上清用镍柱对CSP1重组蛋白进行亲和层析纯化,再经PBS透析液透析后,最终获得可溶的具有生物活性的CSP1重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为281 nm,测定竞争性荧光探针1-NPN与CSP1的相互作用,用Scatchard方程计算其解离常数,再计算获得CSP1与各种候选化学信息素的亲和力。以CSPMbra A6晶体结构(PDB代码:1n8v)为模板,通过同源建模和分子对接解析CSP1蛋白与化学信息素的结合模式,根据Mol Dock Score选出最佳对接模型进行作用机理分析,获得结合时配基周围的CSP1残基分布以及氢键产生情况,以此获得信息素与CSP1的结合模式。最后将CSP1免疫注射兔子获得多克隆抗体,并对中蜂工蜂触角进行低温固定、脱水和包埋后进行超薄切片,然后对样品切片进行免疫胶体金电镜定位,以解析CSP1在触角感器中的亚细胞分布。【结果】成功诱导获得可溶性的重组中蜂CSP1蛋白,利用荧光光谱分析1-NPN与CSP1的解离常数K1-NPN为2.1μmol·L~(-1),结合位点数n为0.99,表明结合时基本以1:1结合,线性相关系数为0.9933。在9种化学信息物质中,CSP1与两种蜜蜂蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)和9-羰基-2癸烯酸(9-ODA),和植物挥发物成分3-蒈烯均具有较强的结合能力,其中与CSP1亲和力最强的对羟基苯甲酸甲酯的[IC50]和解离常数KD分别达到10.1和7.68μmol·L~(-1)。分子对接显示不同配基与CSP1的结合分别是通过与CSP1疏水腔中特定氨基酸残基(或借助于氢键)作用结合。典型的如CSP1与HOB相互作用过程中,预测主要由8个氨基酸残基贡献能量,包括4个疏水性残基(Phe30、Phe44、Leu70和Phe85),3个极性中性残基(Tyr26、Tyr27和Ser41)以及1个酸性残基(Asp40),其中Asp40中两个羧基上的氧原子分别与HOB苯环中羟基上的氧原子分别产生一个氢键。免疫电镜定位结果显示CSP1主要表达于板形感器周围附属支持细胞中,少量表达于感器内部,这与气味结合蛋白的定位存在明显区别。【结论】中蜂CSP1与两种蜂王信息素成分和某些植物花香成分具有较强的结合能力,集合了信息素结合蛋白和普通气味结合蛋白的功能和相似的作用模式,但其亚细胞定位与气味结合蛋白存在明显区别,显示化学感受类蛋白生理特征的多样性。     

王浆高产蜜蜂和原种意大利蜜蜂雄蜂卵期发育蛋白质组分析

 【目的】比较王浆高产蜜蜂（Apis mellifera L.浆蜂）与原种意大利蜜蜂（Apis mellifera L. 原意）雄蜂卵期3 d发育阶段蛋白质组的特点。【方法】根据双向电泳所得表达谱,对两个蜂种雄蜂卵期发育的蛋白质的种类、等电点、分子量和表达量进行分析。【结果】浆蜂雄蜂卵期所表达的蛋白数（332、377和339）显著的高于相应日龄原意雄蜂卵期3个日龄所表达的蛋白数（283、305和293）（P＜0.05）,其中在两蜂种3个日龄共同表达的蛋白数为254个。通过雄蜂卵期3 d发育过程蛋白质表达谱的比较,两个蜂种分别检测到274、298 和285个共有蛋白。在这些共有蛋白中,浆蜂雄蜂分别有54、42和47个蛋白的表达量显著高于（P＜0.05）原意,18、75和61个蛋白显著低于（P＜0.05）原意。同时,浆蜂还检测到58、79和54个特异蛋白,而原种意大利蜜蜂也分别检测到9、7、8个特异蛋白。【结论】浆蜂和原意雄蜂卵期发育的蛋白质组表达谱存在显著差异,但都在2日龄蛋白表达最活跃;两个蜂种雄蜂卵期发育所表达的共有蛋白可能是其发育所必须的管家蛋白,但它们的表达模式存在较大差异,不同日龄的特异蛋白表明雄蜂卵在不同的发育阶段需要不同的蛋白来调控;浆蜂和原意雄蜂卵期表达的特异蛋白是否是与王浆高产相关的功能蛋白,有待进一步的研究。