叶肉细胞特异表达焦磷酸化酶基因OsIP1在不同源库类型水稻品种中的效应

 将水稻自身焦磷酸化酶基因OsIP1置于叶肉细胞特异表达启动子下,利用农杆菌介导法将嵌合基因cyFBPase:OsIP1分别导入“源限制型” 水稻品种中超123和“库限制型” 品种农垦57。 根据荧光定量PCR结果和农艺性状,筛选高表达且农艺性状没有明显改变的T2转基因纯合株系,用以检测和分析在水稻叶肉细胞中特异性过表达水稻焦磷酸化酶基因的效应。初步的研究结果显示：1）在营养生长期,转基因株系的最高茎蘖数和穗数比各受体亲本均有不同程度的提高,尤其是在分蘖性较强的品种上;2）在籽粒灌浆结实期,叶片、叶鞘中可溶性总糖、蔗糖和淀粉含量在整个灌浆期的变化趋势与对照相似,且多数转基因植株叶片和叶鞘中的蔗糖含量（除了灌浆高峰期时的叶鞘）均显著高于对照;3）转基因株系单株干物质量较野生型对照有显著提高。单株产量呈现不同程度的增加,其中“源限制型”品种中超123转基因株系单株产量较对照增幅达显著水平。     

芒果无机焦磷酸酶基因的克隆及其表达载体构建

无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase,PPase）催化焦磷酸（PPi）水解为2个无机正磷酸（Pi）,是蔗糖合成途径中的调控关键节点之一。本研究根据已经报道的PPase基因的序列设计兼并引物,采用3′ RACE和5′ RACE方法,从贵妃芒果的果实中克隆得到了一个芒果PPase基因,将其命名为MiPPase,其全长cDNA序列为1014 bp,开放阅读框为837 bp,编码278个氨基酸,分子量为30.85 ku,等电点为4.68。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与红花烟草具有较近的亲缘关系。为深入探究MiPPase基因在蔗糖代谢过程中的作用,本研究成功构建出pGreenII 62-SK-MiPPase基因过量表达载体,为后续研究MiPPase基因在芒果果实蔗糖合成的作用机理提供理论依据。     

无机焦磷酸化酶基因的克隆与植物表达载体的构建

提取面包酵母基因组DNA,用无机焦磷酸化酶(PPase)基因特异引物通过PCR扩增出864bp的片段,并将该片段克隆至pMD18-T上。序列分析结果表明,该克隆序列与GeneBank上的PPase基因序列同源性达到100%。进一步将叶肉细胞特异性启动子rbcS和PPase基因克隆至植物表达载体pCBI上,构建了由rbcS启动子调控的PPase基因植物表达载体pCBIPR。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中,为农杆菌介导的PPase基因对植物的遗传转化奠定基础。     

披碱草(Elymus dahuricus)焦磷酸化酶基因EdHP1的克隆及功能鉴定

为了从抗逆性优良的牧草中挖掘新的耐盐、抗旱基因,进而为作物分子育种提供优良的基因资源,采用RACE(Rapid-Amplification of cDNA Ends)方法,克隆了披碱草的焦磷酸化酶基因EdHP1,其全长序列包含2310bp,编码770个氨基酸,含有14个跨膜区,是一个典型的膜蛋白,同时包舍三个保守区(CS1、CS2和CS3).氨基酸同源性比较发现,EdHP1与来自大麦等10种高等植物的焦磷酸化酶基因的同源性大于86%.EdHP1基因的表达受干旱、高盐和低温等非生物胁迫的诱导.功能分析证明,EdHP1基因能够显著提高转基因烟草对干旱、高盐胁迫的抗性,可用于作物的抗逆遗传改良.     

乙烯处理对玉米胚乳发育过程中淀粉合成的影响

以玉米自交系B73为试验材料,研究施用外源乙烯之后对胚乳内淀粉合成的影响。结果表明,在玉米10展叶时期施用400 mg/L的乙烯利水溶液显著降低玉米百粒重和淀粉含量。淀粉合成相关酶活性测定结果表明,处理组中ADP葡萄糖焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶、蔗糖合成酶的活性均显著下降。淀粉合成相关基因表达量分析结果表明,处理组中ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因ZmSH2、可溶性淀粉合成酶基因ZmSS1、蔗糖合成酶的基因ZmSH1表达量低于对照组。由此推测,外源乙烯通过调控淀粉合成相关基因的表达与酶的活性影响玉米胚乳内淀粉的合成。     

橡胶树3个可溶性无机焦磷酸酶基因的原核表达

焦磷酸酶对橡胶的生物合成具有重要的调控作用.将已克隆的3个可溶性无机焦磷酸酶基因的编码区插入到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建3个焦磷酸酶基因表达载体(pGEX-HbSIPl、pGEX-HbSIP2和pGEX-HbSIP3),再将表达载体转人大肠杆菌表达菌株进行诱导表达.结果表明:pGEX-HbSIP1、pGEX-HbSIP2表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,pGEX-HbSIP3只在补充稀有密码子的大肠杆菌Rosetta (DE3)中表达,表达率分别为35.4％、43.7％和18.5％.对原核表达的蛋白质进行纯化,获得3种可溶性重组蛋白GST-HbSIP1、GST-HbSIP2和GST-HbSIP3,总回收率分别约为7％、8％、3％.该结果为进一步研究这3种焦磷酸酶蛋白的分子特性、抗体制备及功能研究奠定基础.     

巴西橡胶树磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表达模式分析

蔗糖是橡胶生物合成的主要碳源,而磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)是蔗糖合成最后步骤的关键酶,克隆橡胶树SPP家族基因并研究其表达特性,将有助于揭示橡胶树中蔗糖合成代谢的分子调控.本研究利用拟南芥和杨树的SPP氨基酸序列为探针,搜索橡胶树EST和基因组数据库,并设计引物进行PCR扩增,得到1个橡胶树SPP基因的cDNA和基因组序列,命名为HbSPP1.序列分析显示,HbSPP1基因组含有8个外显子、7个内含子,其cDNA序列的编码区(CDS)为1278 bp,编码424个氨基酸,蛋白分子量为48.1 ku,等电点为6.02.进化上,HbSPP1基因与杨树SPP基因的亲源关系比拟南芥要近.组织特异性表达分析发现,HbSPP1在叶片中的表达丰度最高.另外,在叶片不同发育阶段中,HbSPP1在稳定期叶片中的表达明显低于幼期叶片.     

橡胶树产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树中表达模式分析

橡胶树死皮(Tapping Panel Dryness,TPD)是天然橡胶单产提高的主要限制因子之一,给中国橡胶种植业带来巨大经济损失。本文利用RT-PCR技术分析14个产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树树皮中表达模式。研究结果表明,有8个基因在健康橡胶树树皮中上调表达,其分别是法尼基焦磷酸合酶、小橡胶粒子蛋白、橡胶素、蔗糖转运蛋白5、橡胶延伸因子、几丁质酶、HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合成酶,有4个基因在死皮橡胶树树皮中上调表达,他们分别是橡胶转移酶、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶、蔗糖转运蛋白2a和β-1,3-葡聚糖酶;另外,蔗糖转运蛋白2b和蔗糖转运蛋白1表达模式没有发生变化。此结果为深入揭示橡胶树死皮发生分子机制提供新观点。     

甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

甜菜蔗糖磷酸合成酶(Beta vulgaris sucrose phosphate synthase,BvSPS)是甜菜体内控制蔗糖合成的关键酶之一。根据Genbank上的BvSPS序列(Genbank accession no.X X81975),利用RT-PCR方法,从甜菜体内扩增获得了BvSPS基因的cDNA全长,并将其连接到pMD 18-T载体上。通过利用PstI、XbaI和EcoRI对重组质粒pMD 18-T-BvSPS进行酶切鉴定,进一步确定了重组质粒的正确性。利用生物信息学软件分析结果表明,该基因cDNA全长为3138bp,编码1045个氨基酸,蛋白质分子量为118.18kDa,等电点为6.15,该蛋白被预测定位于细胞核内。     

木薯蔗糖合酶(SuSy)基因的表达分析及SuSy1和SuSy4编码序列的克隆

依据拟南芥6个蔗糖合酶基因序列搜索木薯基因组数据库,获得了6个木薯蔗糖合酶基因亚型。将6个木薯蔗糖合酶基因亚型的外显子-内含子结构进行分析,结合其它物种蔗糖合酶基因的氨基酸序列构建进化树,将木薯蔗糖合酶基因可分为三类,分别为Su Sy1/Su Sy4,Su Sy2/Su Sy3和Su Sy5/Su Sy6。以木薯KU50的功能叶和5个不同时期块根的RNA为模板,利用RT-PCR的方法对蔗糖合酶基因家族进行表达分析,确定了Su Sy1和Su Sy4高表达的亚型,克隆并获得了Su Sy1和Su Sy4基因的编码区序列,对获得的序列进行同源性和功能结构域分析表明,2条序列的氨基酸同源性为97%,并且有相同的功能结构域。     

Inhibition of potato tuber sprouting: Low levels of cytosolic pyrophosphate lead to non-sprouting tubers harvested from transgenic potato plants

Summary ExpressingE. coli inorganic pyrophosphatase in transgenic plants demonstrated that long distance sucrose transport is dependent on cytosolic pyrophosphate. It was speculated that removal of cytosolic pyrophosphate would impair sucrose utilization during storage of potato tubers and thereby prevent tuber sprouting. To explore this hypothesisSolanum tuberosum var. Désirée plants were transformed with a chimeric PPa gene. FollowingAgrobacterium mediated transformation, metabolite and carbohydrate contents of growing and stored tubers were measured. There was a large accumulation of soluble sugars and a decrease of starch at all developmental stages investigated. The PPase activity in PPaII tubers was parallel with a decrease of PPa, an increase of fructose-2,6-bisphosphate and an increase of UDP-glucose. As expected the amount of hexose-6-phosphates and glycolytic intermediates decreased. As a consequence PPaII tubers did not sprout even after a prolonged storage period of two years. Since the energy status of PPaII tubers is unaltered inhibition of sprouting is most likely due to reduced sucrose export and its subsequent utilization.     

缺磷条件下蔗糖对水稻磷素吸收利用起重要作用

 研究了水稻缺磷条件下蔗糖对其生长、磷素吸收利用的影响。结果表明,外加蔗糖可以提高水稻缺磷条件下的生物量,可以促进水稻缺磷条件下的磷素吸收;利用磷转运蛋白基因OsPT2启动子+ GUS报告基因转基因水稻材料,进一步探讨了蔗糖在水稻缺磷条件下促进磷素吸收利用的分子机理。结果表明,水稻磷转运蛋白OsPT2参与了蔗糖促进缺磷水稻的磷素吸收与转运。     

Characterization of a Maize Sucrose–phosphate Synthase Protein and Its Effect on Carbon Partitioning in Transgenic Rice Plants

Abstract

We obtained transgenic rice (Oryza sativa L. cv. Nipponbare) plants with the gene for maize sucrose-phosphate synthase (EC 2.4.1.14, SPS). Some of the transgenic plants over-expressed maize SPS (over-expressing plants) and some had reduced levels of native SPS protein (co-suppressed plants). There was a positive correlation between the amounts of maize SPS protein and SPS activities. However, apparent Km values for uridine diphosphoglucose (UDPG) were higher in over-expressing plants than in control rice plants. These results suggest that overproduced maize SPS protein was not fully activated. The sucrose contents did not differ significantly between control and over-expressing rice plants, but they were lower in co-suppressed plants than in control plants. The starch contents were negatively and the sucrose/starch ratios were positively correlated with SPS activities. Thus, carbon partitioning in the transgenic rice was changed, even though rice is predominantly a sucrose-former.     

超表达蔗糖转运蛋白基因OsSUT1对水稻形态和生理的影响

目的 磷对植物细胞内蔗糖和淀粉合成有重要影响,它们之间的关系还有许多方面有待阐明。方法 本研究利用转基因技术获得OsSUT1超表达材料,通过水培和盆栽实验研究了超表达该基因对蔗糖、磷含量以及植株形态和生理性状的影响。结果 转录水平上的表达分析显示,缺磷诱导OsSUT1在水稻根系中表达。水培实验显示,与野生型相比,正常供磷条件下OsSUT1超表达导致水稻植株地上部蔗糖含量下降,同时水稻植株内的磷含量升高;而在缺磷条件下植株体内蔗糖及磷含量均无显著变化。盆栽实验显示,超表达OsSUT1提高了水稻的分蘖数、有效分蘖数、磷含量、粒长和粒宽。结论 这些结果说明OsSUT1对水稻的蔗糖和磷含量以及种子的生长发育有重要作用。     

Polyphosphate Accelerates Transformation of Nonstructural Carbohydrates to Improve Growth of ppk-Expressing Transgenic Rice in Phosphorus Deficiency Culture

Crop yield and quality are often limited by the amount of phosphate fertilizer added to infertile soils, a key limiting factor for sustainable development in modern agriculture. The polyphosphate kinase(ppk) gene-expressing transgenic rice with a single-copy line(ETRS) is constructed to improve phosphate fertilizer utilization efficiency for phosphorus resource conservation. To investigate the potential mechanisms of the increased biomass in ETRS in low phosphate culture, ETRS was cultivated in ...     

转基因水稻中重组植酸酶的表达

为通过在转基因植株中表达植酸酶降解植酸来提高水稻中无机磷利用率,构建了由玉米泛素基因Ubi启动子控制的植酸酶基因植物表达载体,并以来源于水稻未成熟胚的愈伤组织作为转化受体,经农杆菌介导法将植酸酶基因导入水稻中,共获得15个独立的转基因株系。对转基因水稻总DNA的PCR和Southern 杂交分析证明目的基因已整合入转基因水稻植株基因组中,并能稳定遗传。对部分转基因水稻未成熟种子总RNA进行RT PCR分析,表明导入的植酸酶基因能够在转基因水稻种子中正常表达。无机磷含量分析表明含目的基因的转基因水稻种子及其后代叶片中的无机磷含量较未转化植株均有了明显的提高。     

灌浆结实期高温对水稻籽粒蔗糖及降解酶活性的影响

选用水稻品种越光和笹锦为材料,在开花后设置自然温度和高温两种处理,研究了不同温度处理下籽粒蔗糖、果糖和葡萄糖含量的动态变化以及蔗糖合酶、液泡型转化酶和细胞壁结合型转化酶活性的差异。高温处理下,蔗糖合酶活性值大于转化酶活性值,且与淀粉积累速率呈显著正相关,表明蔗糖合酶在蔗糖的分解和淀粉的合成过程中起着重要作用;高温下两品种籽粒的蔗糖含量明显增加,但分解的葡萄糖和果糖含量并未相应增加,表明高温有利于籽粒中蔗糖的积累,而不利于籽粒中蔗糖的分解。高温下蔗糖合酶、液泡型转化酶和细胞壁结合型转化酶活性明显下降,表明蔗糖分解速率的下降与蔗糖合酶和转化酶活性下降有关。