抗草甘膦基因(EPSPS)植物双价表达载体的构建

针对目前报道的抗草甘膦转基因作物中,强组成型启动子驱动抗草甘膦基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达,增加植株代谢负担,对植物的产量可能引起负效应的这一问题,利用Ag2这种草甘膦胁迫诱导启动子来驱动epsps基因,只在草甘膦喷施后高效表达对草甘膦的抗性.另外,同时利用具有组织特异性的启动子RuBP,使epsps基因在植物草甘膦农药田间喷施主要部位叶片中高效表达,应可以进一步增强转基因植物的抗草甘膦能力,但又不致过多地增加转基因植物的代谢负担,以利培育高抗草甘膦且农艺性状优良的转基因植物.实验分别以pBI121-E-M-Bt(Kanar)和pBI121-CP4E(Kanar)质粒为基础,通过载体pUC19及对EcoRⅠ位点的接头改造,构建了由RuBP启动子和新发现的诱导型启动子Ag2共同调控epsps基因的植物表达载体pGBI-Ag2EM-RuBPEM和pGBI-Ag2CP4E-RuBPCP4E,选择标记为卡那霉素,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,获得了T0代种子,为利用epsps基因改良植物对草甘膦的抗性奠定了物质基础.     

分别转CP4 EPSPS和aroA基因拟南芥对草甘膦的抗性

杂草和农作物竞争水分、养料以及光照,增加农业生产成本,影响农作物的产量和品质,利用化学方法来控制杂草已成为现代农业不可缺少的一部分.     

转基因抗草甘膦棉花对草甘膦的耐受性研究

为了明确转基因抗草甘膦棉花10-6001对除草剂草甘膦的耐受性,以转基因抗草甘膦棉花材料10-6001和常规棉花品种冀棉958（ CK）为试验材料,在棉苗6片真叶时叶面喷施不同浓度〔0（不喷施除草剂,人工除草, CK）、0.25％和0.50％〕的草甘膦溶液,分别于施药后0（当天下午）、1、7、14和21 d调查棉花的株高、药害级别、受害指数和死苗率,施药后35 d 调查棉花的死苗情况;分析2种棉花对不同浓度草甘膦的反应程度,并对其株高差异进行了显著性方差分析。结果表明：转基因抗草甘膦棉花品系10-6001对草甘膦的耐受性很好,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花在整个试验期间药害均较轻,表现为植株矮化,生长减慢,叶片略变小,且无死苗,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均不显著;随着时间的延长,药害逐渐缓解。而常规品种冀棉958对草甘膦的耐受性很差,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花药害症状表现为植株矮化,生长缓慢,叶片变小、枯黄、褐化干枯,并且药害程度随着时间的延长而加重,药害级别和受害指数均高于10-6001,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均达到了极显著水平,施药后35 d部分棉花出现整株枯死。     

牛筋草对草甘膦的抗药性

【目的】明确广东省果园或菜田田埂牛筋草（Eleusine indica）对草甘膦（glyphosate）的抗药性水平。【方法】利用整株测定法测定广东省广州市、惠州市、梅州市等地共7个点牛筋草对草甘膦的抗药性水平;采用紫外分光光度计测定抗性水平差异最大的2种牛筋草体内莽草酸含量的差异;采用光纤型双通道PAM-100测定抗性水平差异最大的2种牛筋草叶片各自叶绿素荧光参数的差异。【结果】惠州市杨村番石榴园（以下简称杨村）牛筋草对草甘膦的相对抗性指数达11.0,试验结果与田间实际反映情况相吻合;莽草酸含量测定结果表明,1 845 g a.i./hm2草甘膦处理后0-7 d,杨村牛筋草植株内部莽草酸含量较低,与对照相当,而广州番禺牛筋草植株内部积累了较多莽草酸,草甘膦处理后7 d,其莽草酸含量（623.1 µg•g FW-1）为杨村牛筋草（68.1 µg•g FW-1）的9.1倍;叶片荧光参数结果表明,杨村牛筋草Fv/Fm（PSⅡ最大原初光能转化效率）、α（PSII光响应曲线的初始斜率,代表了植物对光能的利用效率）值均高于广州番禺牛筋草,且值较稳定,而广州番禺牛筋草Fv/Fm和α在草甘膦处理5 d后均降为0。【结论】广东省部分果园或菜田田埂牛筋草对草甘膦已产生不同程度的抗药性,其中杨村牛筋草抗性最高;杨村牛筋草体内积累的莽草酸很低,植株光合系统基本未受到影响,光合作用正常进行。     

农田杂草对甲磺隆的抗性试验

 报道了1997～1998年两年间抗性观察圃施用除草剂甲磺隆后,杂草种类的变化,总趋势是杂草种类增多、多年生杂草上升。其中三叶鬼针草表现数量由少变多,植株高度随甲磺隆处理浓度加大而变矮的抗性变化现象。     

酵母菌S-2对草甘膦除草剂的降解特性

[目的]从福建三农集团污水处理池的活性污泥中分离草甘膦降解菌株,研究其降解特性。[方法]采用富集驯化和选择性培养,分离能以草甘膦为唯一碳源、氮源的酵母菌S-2,对其降解特性进行了研究。[结果]适宜菌株S-2生长和获得最佳降解率的条件为：接种量4%、pH值7.0、温度30℃、转速130～160r/min。[结论]该研究为草甘膦的生物降解与污染土壤的生物修复提供必要的参考。     

生物测定法测定棉田牛筋草对草甘膦的抗药性

为了明确湖南省棉田牛筋草对草甘膦的抗药性情况,在采集各地棉田牛筋草种子的基础上,采用室内生物测定法测定了其对草甘膦的抗药性水平。结果表明:采自常德澧县和常德桃源的牛筋草种群的相对抗药性倍数均较高,分别为10.21和7.79,处于中等抗性水平;采集自湘西慈利的牛筋草种群的相对抗性倍数为4.60,处于较低抗性水平;而采集自益阳桃江等地的牛筋草种群的相对抗性倍数均处于1~3。由此表明在湖南省棉花部分产区的牛筋草种群已经产生了对草甘膦的抗药性。     

抗咪唑啉酮油菜对非选择性除草剂的抗性效应

探明抗咪唑啉酮油菜对非选择性除草剂咪唑乙烟酸的抗性效应及该突变体的应用价值,为选育具有自主知识产权且不受环境释放限制的抗除草剂油菜新品种提供科学依据。采用田间浓度梯度试验,在喷施咪唑乙烟酸后10 d、20 d、35 d、50 d和65 d取样,测定株高、叶片数、最大叶面积及干物质等,分析不同浓度药剂对油菜苗期生长的影响。油菜成熟时考察植株性状、主要经济性状及单株生物学产量,测定菜籽的油分、蛋白质、硫苷含量和全脂肪酸组成,分析不同浓度处理对抗性油菜植株、经济性状和品质性状的影响。结果显示:高浓度(135 g/hm2,ai.和180g/hm2,ai.)处理对抗性油菜苗期叶片生长和主茎伸长有明显抑制作用,从而影响植株地上部干物质积累,对成熟油菜的植株性状和经济性状也有显著影响;低浓度(45 g/hm2,ai.和90 g/hm2,ai.)处理对油菜早期生长有一定的抑制作用,喷药后35 d叶面积已恢复到对照(不喷咪唑乙烟酸)的92.94%,喷药后65 d苗高已恢复正常,对成熟油菜的植株性状和经济性状虽有不同程度的影响,但差异均未达显著水平;不同浓度梯度的咪唑乙烟酸处理,对抗性菜籽品质均无不良影响;咪唑乙烟酸除草剂的最低有效剂量ED90为45 g/hm2,ai.,抗性油菜使用咪唑乙烟酸的最高安全剂量ED10为108.59~190.77 g/hm2,ai.,选择系数均在2以上,因此该抗性油菜的抗性较强,具有生产实用价值。     

肺炎克雷伯氏菌S001草甘膦靶标酶基因的克隆及其抗性验证

【目的】由于草甘膦在农业生产中的广泛使用,抗草甘膦转基因作物的研究一直是转基因作物研究的热点,其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心问题。自然界中微生物种类繁多,基因资源丰富,论文拟从广东地区农田土壤中筛选和鉴定出高抗草甘膦菌株,克隆其草甘膦靶标酶基因并进行抗性水平验证,以期获得高抗草甘膦新基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。【方法】用含有浓度梯度草甘膦的选择培养基从备选土壤中筛选出具有高抗草甘膦特性的菌株;通过显微观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析结果对菌株种类进行鉴定;利用RT-PCR技术克隆该菌株的草甘膦靶标酶基因aroAS001,并通过序列比对和系统发育树分析aroAS001序列的基本特征;利用重叠 PCR法对aroAS001变异位点进行定点突变获得aroAS001-mut序列后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段转入aroA基因缺陷型菌株DH5α/△aroA中进行基因功能互补和草甘膦抗性水平验证。【结果】分离出一株高抗草甘膦菌株,经形态学和分子生物学鉴定该菌株为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）,命名为kpS001;克隆该菌株草甘膦靶标酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）基因aroAS001,序列分析结果显示由该基因所编码的氨基酸序列具有典型的Class I EPSPS特征,但与已报道肺炎克雷伯氏菌的aroA相比其第227位碱基发生突变,致使对应的氨基酸发生变异。对该基因差异位点进行核酸定点突变获得aroAS001-mut基因片段后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段分别转入缺陷型大肠杆菌菌株DH5α/△aroA进行功能互补验证,与对照菌株相比,转入aroAS001和aroAS001-mut的重组菌株均能在含200 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中能够正常生长,表现出良好的抗性,之后随着草甘膦浓度增加其生长状态开始受到抑制,当草甘膦浓度达到350 mmol?L-1时,菌株生长基本完全被抑制。【结论】肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株是一株高抗草甘膦菌株,由aroAS001编码的草甘膦靶标酶EPSPS属于Class I EPSP合成酶,aroAS001对草甘膦具有优良抗性,能在含350 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中生长,该基因可以作为备选基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。     

GNA和ACA双价转基因烟草培育及其抗蚜研究

蚜虫是一种常见的农作物害虫,作为多种植物病毒的载体而成为影响农业发展的重要害虫之一,对蚜虫的防治一直是众多科学工作者所面对的难题。构建了雪花莲凝集素(GNA)和苋菜凝集素(ACA)双价植物表达载体pBI121-GA,在农杆菌介导下,叶盘法转化烟草NC89,得到卡那霉素抗性植株65株。通过基因组PCR、ELISA、RT-PCR和Western-blot等分子生物学检测,从中筛选出外源凝集素不同表达水平的转基因烟草5株。对筛选出的5株转基因烟草植株进行初步蚜虫抗性实验,证实转基因烟草对桃蚜表现出一定的抗性,最高抑制率达85.8%,为农作物双价抗蚜基因的应用研究提供一定的理论基础。     

杂草抗药性生物型的研究进展

简述了抗药性杂草生物型现状及其发展动态,综述了杂草抗药性产生的原因和抗性机制的研究进展。     

抗除草剂基因基因枪法转化粳稻的研究

优化了粳稻的组织培养体系;通过Gus基因的瞬间表达研究,明确了以DNA金弹到靶细胞距离为9cm,轰击2次时,PDS1000/He基因枪法转化水稻胚性愈伤组织的效率最高。应用基因枪法将抗除草剂基因(bar)转入吉林省主栽的水稻品种长白8号中,获得了可育的转基因水稻植株。经过Gus基因的组织化学分析,PCR和Southern杂交检测,证明抗除草剂基因已整合到水稻基因组中得以表达,使水稻产生对除草剂的抗性。转基因水稻中发现一例基因沉默现象。     

少花龙葵和三叶鬼针草对甲磺隆抗性的初步研究

 在施用甲磺隆的抗性观察圃里,跟踪调查杂草的抗性生物型,采集表现抗性的杂草——少花龙葵和三叶鬼针草种子,用生物测定和生化分析方法,进行其抗性水平测定。结果表明,连续2年4次施用甲磺隆的少花龙葵和三叶鬼针草,只有少花龙葵表现抗性（抗性因数为2.19,等浓度防效降低29%,敏感性比为1.58,乙酰乳酸合酶的活性比为1.61）。 三叶鬼针草的抗性差异不明显。     

油菜田看麦娘对10.8%高效盖草能抗性及对几种除草剂交互抗性的研究

研究油菜田杂草看麦娘对10.8%高效盖草能抗性及对几种除草剂的交互抗性。结果表明:看麦娘对10.8%高效盖草能产生了抗性,土壤的高含水量是其产生抗性的重要因素;同时对同属芳氧苯氧丙酸类的5%精禾草克存在交互抗性,但对不同属的环己烯酮类除草剂10%快捕净和酰胺类除草剂50%Kerb依然敏感,无交互抗性。     

基于WGCNA鉴定茶树响应草甘膦相关的基因共表达模块

【目的】分析茶树响应草甘膦相关的基因表达规律和调控途径,在转录水平上探究草甘膦对茶树的作用,确定茶树响应草甘膦的关键基因。【方法】以茶树品种‘金观音’为试验材料,将推荐使用浓度的草甘膦施于茶树土壤基质表面,经0、0.25、1、3和7 d后,取叶片进行转录组测序,并测定莽草酸含量。利用WGCNA方法联合分析转录组和莽草酸含量数据,鉴定与草甘膦响应相关的共表达基因模块,筛选关键调控基因。【结果】茶树叶片中的莽草酸含量在草甘膦处理后0.25、1和3 d降低,而在7 d时大量积累（为未处理的6.99倍）。从表达谱数据中筛选得到12 568个差异表达基因（DEGs）,草甘膦处理不同时间点与未处理数据比对的DEGs均显著富集在苯丙烷、类黄酮生物合成及植物激素信号转导途径;此外,草甘膦处理分别诱导茶树莽草酸代谢及其下游苯丙烷、类黄酮生物合成和激素信号转导途径相关的24、52、31和69个基因差异表达。通过加权基因共表达网络（WGCNA）方法鉴定得到19个基因模块,将转录组与莽草酸含量数据相关联,筛选到两个与草甘膦响应高度相关的关键基因模块,分别包含2 024和2 305个基因。选取关键模块中连通度最高的前50个基因进行共表达分析,获得6个关键调控基因,包括2个抗性基因（SHMT和RPM）、1个耐药性基因（PDR）、1个离子转运基因（At）、1个膜转运基因（GPT）和1个转录因子（ERF）。【结论】草甘膦通过干扰茶树叶片中莽草酸代谢,影响其下游代谢途径苯丙烷、类黄酮生物合成及激素信号转导途径的基因转录。此外,研究还鉴定到2个草甘膦响应密切相关的共表达模块,发现SHMT、RPM、At、PDR、ERF和GPT等多个潜在候选基因和转录因子在茶树抵御草甘膦逆境中发挥重要作用。     

Genetic Stability of Resistance of Bean （Phasedus vulgaris L.） to Glyphosate

Thirty lines of bcan were tested for resistance to glyphosate in the field.Obvious difference in resistance response to glyphosate was detected when glyphosate was applied at the rate of 1kg ai/ha on the 15th day after emergence of seeclings.The ling 89-05 showed high resistance with a survival of 77%.Even after glyphosate was reapplied.the survival rats was still 20%,Obvious segregation was found in Progency of 89-05 for resistance to glyphosate;the survival rate of lined 89-05-1 89-05-2 and 89-05-3 were,respectivcly,42.3%,51.4% and 85.7%,at 1kg ai/ha of the herbicide with a survival of 77%.Even after glyphosate was reapplied.the survival rate was still 20%,Obvious segregation was found in progency of 89-05 for resistance to glyphosate;the survival rate of lined 89-05-1 89-05-2 and 89-05-3 were,respectively,42.3%,51.4%and 85.7% at 1kg ai/ha of the herbicide.Progenies 89-05-3 continued to show resistance and lines 89-05-3-5and 89-05-3-7 both had a survival rate of 100%,When glyphosate was applied with a rate over 1keqia/ha,the survival rate of the 89-05-3-5 was still between 50%-98%.     

生物技术在亚麻抗除草剂育种中的应用研究进展

对近20年来,生物技术在亚麻抗除草剂育种领域中研究的意义及国内外研究现状进行了综述,内容包括：细胞工程技术在亚麻抗除草剂育种中的应用研究进展,基因工程技术在亚麻抗除草剂育种中的研究进展,以及生物技术在亚麻抗除草剂育种中存在的问题。     

抗除草剂基因在粳稻恢复系中的基因枪转化及其在后代中的表达

利用基因枪法把抗除草剂基因bar基因导入粳稻恢复系超优一号,经PCR,PCR-southern杂交分析,证明外源基因已整合到水稻基因组中,且能稳定遗传;田间喷施除草剂抗性检测结果表明,bar基因在转基因恢复系及后代中均表达,表现抗除草剂,在恢复系与不育系所配制的杂交种中,高效表达,表现高抗除草剂;部分转基因植株T1代分离比符合孟德尔显性单基因的遗传规律,即3∶1规律,部分不符合。     

转基因抗草甘膦棉花及其对草甘膦抗性的时空表达

草甘膦是一种非选择性除草剂,它通过竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)干扰芳香族氨基酸的生物合成而发挥毒性作用。虽然获得抗草甘膦棉花的途径有多种,但当前用于生产的抗草甘膦棉花主要是以CP4-EPSPS基因转化棉花获得的。草甘膦对转CP4-EPSPS棉花的营养生长没有不利影响,但4叶期后喷施草甘膦会显著降低花粉粒的活性,抑制散粉、授粉和结实,导致转CP4-EPSPS棉花对草甘膦抗性呈现出一定程度的时空变化。草甘膦对抗草甘膦棉花(雄性)生殖器官的抑制效应一方面源于草甘膦在生殖器官内的大量积累,另一方面在于CP4-EPSPS基因在(雄性)生殖器官的低效表达。促进CP4-EPSPS基因在全株高效表达是提高棉花对草甘膦抗性的重要途径。     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。