小鼠胚胎常规冷冻和玻璃化冷冻效果的比较

将小鼠胚胎分别用常规冷冻法和OPS法冷冻，结果用常规冷冻法和OPS法冷冻小鼠桑葚胚，解冻后培养24h胚胎的发育率分别为87．32％、86．67％（P〉0．05）；用两种方法冷冻小鼠囊胚的结果分别为81．43％、83．56％（P〉0．05），结果表明用OPS法冷冻保存小鼠胚胎能达到用常规冷冻法的效果。     

牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养的研究

探讨了人工合成培养液ＣＲ１ａａ和小鼠胎仔成纤维细胞对牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明，牛体外受精卵在ＣＲ１ａａ液中的卵裂率达７６．２％，８细胞胚的比率达４４．８％。小鼠胎仔成纤维细胞能够显著促进牛体外受精的早期囊胚以上胚胎的发育。牛体外受精后第５、６天的早期胚胎分别与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，在受精后第７天发育至囊胚以上的比率分别达１９．８％和２４．６％；受精后第８天，孵化的囊胚比例分别达５．２％和７．５％。实验表明，受精后第５、６天的牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，可显著提高扩张囊胚和孵化囊胚数量。小鼠成纤维细胞对胚胎发育的支持作用取决于胚胎发育阶段     

早期胚胎体外培养微流控芯片的制备及初步应用

利用微流控芯片模拟输卵管微环境,探讨物理性刺激对早期胚胎发育的影响,为解决早期胚胎体外囊胚发育率较低、胚胎质量差的问题提供帮助。本实验采用一次铸造成型制备微流控芯片培养装置,并应用培养装置对小鼠1-细胞期胚胎进行培养,观察胚胎体外发育率。结果表明,利用微流控芯片培养组与对照组2相比,2-细胞胚胎发育率差异不显著(P0.05),但是,在8-细胞胚胎发育率、桑葚胚发育率和囊胚发育率都差异显著(P0.05)。此外,囊胚内总细胞数显著提高(P0.05)。结论:一次铸造成型微流控芯片制作方法简便易行且培养液不易外漏,这种培养装置能显著提高小鼠早期胚胎体外囊胚发育率和胚胎的质量。     

小鼠皮肤成纤维细胞的体细胞核移植

取成年小鼠唇部皮肤进行培养，分离成纤维细胞并血清饥饿培养1周，用作核供体。对成年小鼠进行超排，取卵母细胞用作核受体，核移植重构胚经SrCl2激活处理6h后，同mM16培养液和小鼠输卵管上皮细胞共培养，把发育到早期囊胚的重构胚转移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加ES细胞条件培养液，消化分离ICM，然后接种培养，对孵出的ES细胞样集落进行鉴定培养。结果显示，小鼠唇部皮肤成纤维细胞为核供体，核移植重构胚2-细胞率为54．05％，桑椹胚率17．14％，囊胚率6．90％，对照组卵丘细胞的核移植重构胚2-细胞率为60．00％，桑椹胚率21．85％，囊胚率11．69％，但2种供体细胞在支持核移植重构胚发育能力上差异不显著。成纤维细胞重构囊胚中6个囊胚分离出ES细胞样集落，3个ES细胞样集落可稳定传代；对照组卵丘细胞重构囊胚中9个囊胚中分离出ES细胞样集落，5个ES细胞样集落可稳定传代。从核移植重构胚中分离出的ES细胞样集落具有岛状或巢状群体生长形态，生长旺盛的集落可自发分化成单个散在或片状存在的上皮样或梭形细胞，碱性磷酸酶检测为阳性，常规冻存复苏，仍显示ES细胞特征。     

YWHAZ在小鼠早期胚胎发育过程中的作用

为了探究YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的表达、定位和作用,本试验利用RT-PCR和Western blot方法检测Ywhaz基因及其编码蛋白在小鼠早期胚胎发育中的表达;利用免疫荧光技术检测YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的定位;使用特异性的siRNA沉默合子中的Ywhaz,在胚胎发育的1.5,2.5,3.0,3.5,4.5,5.0 dpc分别观察2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚的发育率,阐明在合子中沉默Ywhaz基因对小鼠早期胚胎发育的影响。结果显示,Ywhaz mRNA及其编码蛋白在小鼠1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚中均有表达,YWHAZ蛋白定位在小鼠早期胚胎的细胞质和细胞核中。Ywhaz沉默组的2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚的发育率均极显著低于对照组(P<0.01),沉默组5.0 dpc囊胚率显著高于其4.5 dpc囊胚率(P<0.05)。结果表明,Ywhaz mRNA及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎中有表达,其蛋白主要定位在早期胚胎的细胞核和细胞质中;在合子中沉默Ywhaz基因可导致小鼠早期胚胎发育率降低且存在明显...     

小鼠胚胎常规冷冻和玻璃化冷冻效果的比较

将小鼠胚胎分别用常规冷冻法和OPS法冷冻,结果用常规冷冻法和OPS法冷冻 小鼠桑葚胚,解冻后培养24 h胚胎的发育率分别为87．32％、86．67％(P>0．05);用两种方 法冷冻小鼠囊胚的结果分别为81．43％、83．56％(P>0．05),结果表明用OPS法冷冻保存小 鼠胚胎能达到用常规冷冻法的效果。     

黄芩苷、川芎嗪对小鼠体外培养胚胎冷冻-解冻及移植效果的研究

将中药有效成分黄芩苷(Baicalin,Bai)和川芎嗪(Ligustrazine,Lig)添加到小鼠2-细胞胚胎培养液中进行体外培养,比较其体外发育能力,并将体外发育的桑椹胚、囊胚进行2种程序常规冷冻.解冻后形态正常的桑椹胚、囊胚分别培养8～14 h、6～8 h,比较各组胚胎的冷冻-解冻发育效果及冷冻胚胎移植妊娠率和产仔率等.结果各试验组胚胎孵化率,Bai组(80.6%)、Lig组(78.3%)极显著高于对照组(51.8%)(P＜0.01).孵化胚胎细胞计数结果显示, Bai组(81.9±6.2)和Lig组(83.9±7.7)与对照组(77.4±5.6)差异极显著(P＜0.01);程序1和2的桑椹胚解冻囊胚发育率,以Bai、Lig组显著高于对照组;其囊胚解冻存活率,2个试验组均好于对照组.受体妊娠率、产仔率以及初生仔鼠、离窝仔鼠平均体重、离窝成活率等指标,各组间均无显著差异(P＞0.05),但以中药有效成分各组别均好于对照组.结果表明中药有效成分Bai和Lig能显著地提高小鼠 2-细胞胚胎体外发育能力,并有利于提高冷冻-解冻后移植胚胎的发育潜力.     

家畜卵和胚胎冷冻的现行方法及有待研究的问题

近17年来,采用建立起来的牛非手术采卵及冷冻方法,已能将牛桑葚胚和囊胚冷冻,并获得较高的存活率。现在试验中和商业上牛胚胎冷冻大多数是采取控制降温和解冻的程序。解冻后存活率按形态评定可达90％～100％,非手术移植的妊娠率为60％。绵羊、山羊和马的桑葚胚和囊胚用控制降温和解冻程序也能有效的冷冻。简化的控制降温和解冻程序的一步法用于牛胚胎,妊娠率可达50％。此法免去了解冻后较繁琐的脱除冷冻保护剂和胚胎评定过程。玻璃化法和快速冷冻法是较先进的方法,可大大缩短胚胎冷冻时间,而且无需复杂的冷冻设备。不过,迄今家畜胚胎冷冻的结果还是有待提高的,尽管牛、绵羊、山羊桑葚胚和囊胚用玻璃化法冷冻已经成功,移植后产了仔。另外,卵母细胞、早期胚胎、显微手术(切割、克隆、活组织检查)后的胚胎、猪胚胎冷冻成功率还很低。因此,为使胚胎移植技术能在生产中应用和开展胚胎显微操作、体外受精、克隆和基因转移之类生物技术的试验及应用,很有必要加强研究建立起更为有效的胚胎冷冻解冻方法。     

以乙二醇为基础的玻璃化溶液对小鼠扩张囊胚的超低温保存

在家畜胚胎发育中，扩张囊胚是一个非常重要的阶段。其中在牛羊方面第一例成功的胚胎冷冻即是在这个阶段完成的。同时人们已发现在猪囊胚扩张后、胚胎的抗冻力也上升。近年来．通过体外成熟、受精和发育的方法来生产牛的扩张囊胚。然而牛胚胎不论是用各种玻璃化冷冻法还是传统的冷冻方法．效果一直不佳。在超低温冷冻保存的小鼠囊胚的发育率比８细胞胚胎直到桑椹胚阶段的胚胎都低。本研究的目的是利用乙二醇为主的玻璃化溶液探索小鼠扩张囊胚冷冻所需的最适条件。１材料和方法１，１扩张囊胚的收集将６～１２周龄的雌性ＩＣＲ小鼠饲养在明暗…     

猪胚胎冷冻移植成功

将哺乳类动物的胚胎冷冻保存在液氮中的试验已经在一些动物成功,如小鼠(Whit-tingham等,1972),牛(Wilmut和Rowson,1973)、绵羊(Willadsen等,1976)、山羊(Bilton和Moor,1976)和马(Yamamoto等,1982)。牛的冷冻胚胎已经商业化生产。然而,猪胚胎的冷冻和解冻还未获得成功。据报道,猪的胚胎对于低温,即使是+10℃(Wil-mut,1972;Niemann,1985)都极敏感。本研究是检验由桑葚胚到孵出期囊胚各胚龄猪胚胎冷冻-解冻后能否存活。采用有性周期的8～24个月龄、体重120～     

牛半胚冷冻技术的研究

哺乳动物的半胚冷冻技术,是在胚胎分割和冷冻技术的基础上逐渐发展起来的.牛半胚冷冻的意义在于获得不同年龄的同卵孪生牛犊,以加速对优良种牛的选育.Lehn—Jenson首次获得了牛半胚冷冻的同卵孪生犊;Niemann、Brem对分割半胚的冷冻技术进行了深入的研究,取得了一定的成果.本实验采用简易分割方法获得牛半胚,对牛分割半胚冷冻的移植效果作了观察,现简报如下.     

绵羊类胚胎干细胞的分离与克隆

从胚胎发育阶段、饲养层和培养体系等方面对影响绵羊类ES细胞分离、克隆效率的因素进行探讨。结果显示：致密桑葚胚和囊胚的ICM增殖率高于囊胚和孵化囊胚。绵羊类ES细胞在同源绵羊胎儿成纤维细胞（SEF）上生长比较缓慢,最终传代次数也低于小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）组。培养液中同时添加胎牛血清（FBS）和Knock-out血清替代品（KSR）,绵羊类ES传至7代,添加了碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）后,最高可传至8代,而单纯添加KSR或FBS,分别传至4代和5代。对类ES细胞进行AKP染色、核型分析、体外分化试验,证实分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且表达多潜能性细胞因子Nanog。由此认为,致密桑葚胚和囊胚更适合绵羊类ES细胞的体外分离和培养,而且MEF更适合于绵羊类ES细胞的分离传代,培养液中添加5%FBS和15%KSR,比较适合类ES细胞的分离传代,bFGF对绵羊类ES细胞的增殖具有促进作用。     

转sMTPGH基因小鼠胚胎的体外培养

采用纯化的羊金属硫蛋白 (s MT)启动子指导的猪生长激素 (PGH )基因 (s MTPGH)为显微注射片段 ,将其导入小鼠受精卵原核 ,比较了几种不同培养液对导入外源基因的小鼠胚胎体外发育的影响。结果表明 ,改进的 M16培养液(用 m M16表示 )能有效克服 2 -细胞阻断现象 ,并使转基因胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在 m M16培养液的基础上 ,再加入表皮生长因子 (EGF) ,可使 1-细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在 3种培养液 (M16、m M16、m M16 EGF)中 ,转基因胚胎突破 2 -细胞阻断期的比率分别为 12 %、6 8%、90 % ,发育到囊胚期的比率分别是 0 %、2 0 %、4 3%。采用 PCR方法检测 5 7枚经体外培养发育至囊胚的显微注射胚胎 ,4枚扩增出阳性条带 ,外源基因在囊胚期胚胎的滞留率为 7%。     

不同分割液对奶牛不同阶段胚胎分割效果的影响

本试验探讨了3种不同分割液对奶牛桑葚胚和囊胚分割效果的影响。借助显微操作仪，将发育至第6～8天的体内常规生产的桑葚胚和囊胚进行分割，体外培养半胚，观察其发育情况，选择形态恢复好的半胚与一个囊胚滋养层细胞囊泡（trophoblastic vesicles，TRV）共移植。结果显示，在PBS+0.2 mol/L蔗糖与PBS+5%PVP中分割桑葚胚，其分割成功率显著高于PBS（P<0.05），分别为89.13%、86.73%和69.67%，而半胚的囊胚发育率及移植妊娠率三者均无显著差异（P>0.05）；在PBS+0.2 mol/L蔗糖与PBS+5%PVP中分割囊胚， 其分割成功率显著高于PBS（P<0.05），分别为94.52%、92.52%和70.52%，而半胚培养的囊胚发育率及移植妊娠率三者均无显著差异（P>0.05）；说明在PBS中分别添加0.2 mol/L的蔗糖和5%的PVP有利于提高奶牛桑葚胚和囊胚的分割成功率。     

卵母细胞成熟和受精研究的最近进展

本文就培养液中加促性腺激素对于卵母细胞成熟和体外受精的影响进行了探讨。加有LH+E_2、FSH+E_2,及不加激素培养胚胎处理间,合子发育至桑葚胚和囊胚的百分率差异不显著。用不同类型的细胞单层协同培养对于早期胚胎发育的影响试验观察到,在输卵管细胞和子宫细胞组合构成的单层中培养的胚胎比在颗粒细胞单层上培养的胚胎发育更快。有几篇关于分离刺激胚胎发育的输卵管因子的报道认为,在输卵管壶腹部条件培养液中,小鼠1—细胞受精卵发育较好,且证明一种低分子量组分在胚胎发育中起了重要作用。     

OPS法与细管法冷冻小鼠胚胎的研究

用0.25 mL细管和OPS(open pu lled straw)管,对小鼠囊胚进行玻璃化冷冻,以比较2种方法的冷冻效果。结果表明,冷冻-解冻胚胎体外培养24 h后,2组的发育率分别为63.3%(31/49)和71.4%(55/77);OPS法在冻胚发育率上稍优于细管法,但无统计学差异(P>0.05);2组冷冻胚胎的培养发育率均显著低于鲜胚培养组94.3%的发育率(P<0.05)。采用OPS法冷冻小鼠8-细胞胚,其冻后培养发育率为55.6%,似乎要低于囊胚冷冻后的培养发育率,但差异不显著(P>0.05)。     

兔原核胚体外序贯培养

采用添加 10 % FBS的 RPMI16 4 0培养液和 m RPMI16 4 0培养液对兔原核期受精卵进行了体外序贯培养 ,并与添加 10 % FBS的 RD培养液单一培养作了比较。结果显示 :体外培养至 72 h时 ,2个培养组 8-细胞胚率、桑葚胚率和囊胚发育率无显著差异 (P>0 .0 5 ) ,但 RD单一培养组已有 10 .3%出现退化 ,与序贯培养组之间差异显著 (10 .3%比0 ,P<0 .0 5 ) ;体外培养 16 8h,序贯培养组和 RD培养组的贴附率分别为 5 9.7%和 4 1.4 % ,外延生长率分别为 4 3.1%和 2 2 .4 % ,桑葚胚率为 10 0 %和 89.7% ,脱带率为 33.3%和 5 .2 % ,二者之间贴附率、外延生长率差异显著 (P<0 .0 5 ) ,桑葚胚率、脱带率差异极显著 (P<0 .0 1) ;序贯培养 96 h的囊胚细胞数为 (12 4 .6± 6 .36 )个 /枚 ,RD培养同期囊胚细胞数为 (118.2± 5 .2 5 )个 /枚 ,差异显著 (P<0 .0 5 )。结果表明 ,序贯培养能够有效克服兔早期胚胎发育阻滞 ,促进胚胎的正常生长发育 ,提高胚胎质量 ,并能促进胚胎的孵化和附植     

水牛冷冻胚胎分割效果的初步研究

探讨了胚胎分割前后冷冻和不同时期的冷冻胚胎对水牛胚胎分割效果的影响。结果:冷冻后分割组的分割成功率与分割后冷冻组差异不显著(71.39%vs 71.43%,P>0.05),但囊胚冷冻后分割组的半胚发育率显著高于分割后冷冻组(58.33%vs 47.14%,P<0.05);扩张囊胚的冷冻存活率显著高于孵化囊胚(94.84%vs 79.01,P<0.05),但囊胚与孵化囊胚差异不显著(92.67%vs 79.01%,P>0.05),囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚冷冻胚胎的分割成功率(70.76%,73.22%,70.92%)及半胚发育率差异均不显著(53.07%,51.49%,57.99%)(P>0.05)。上述结果说明,水牛囊胚冷冻后分割比分割后冷冻能获得更高的半胚发育率;水牛未扩张囊胚和扩张囊胚的冷冻存活率比孵化囊胚高,且这3个时期的冷冻胚胎均适合分割。     

昆明小鼠早期胚胎体外发育阻滞原因分析

为了分析小鼠早期胚胎在体外发育阻滞的原因 ,建立早期胚胎体外培养系统 ,应用几种不同的培养系统对昆明小鼠单细胞胚胎在体外培养了 96～ 12 0 h。结果表明 ,小鼠单细胞胚胎在 M1 6 和 BWW培养液中卵裂均受到阻滞 ,且两者之间差异不显著 (P>0 .0 5 ) ;CZB和 HTF培养液能有效地克服小鼠胚胎的 2 -细胞发育阻滞 ,与 M1 6 和 BWW相比 ,2 -细胞卵裂率和囊胚率均存在显著性差异 (P<0 .0 1) ;在 M1 6 培养液中添加牛磺酸对早期胚胎发育有促进作用 (P<0 .0 1) ;小鼠早期胚胎在 CZB和牛输卵管上皮细胞 (COEC)共培养体系中的卵裂率较对照组明显提高 (P<0 .0 5 )     

不同发育阶段小鼠胚胎S、M—期卵裂球的检测以及低温对胚胎细胞DNA合成的影响

利用放射自显影技术检测了小鼠着床前胚胎(4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚)不同发育阶段(早、中、晚)S期和M期卵裂球的比率，并研究了低温(4℃)对小鼠胚胎发育及DNA合成的影响。结果显示，早期和中期4-细胞胚胎S期卵裂球比率较高，分别是75%、92%，没有M期卵裂球，晚期4-细胞胚胎S期卵裂球比率较低(30%)，M期卵裂球比率为11%；早期和中期8-细胞胚胎S期卵裂球比率仍很高，分别是73%、80%，M期卵裂球分别为0、2.5%，晚期8-细胞胚胎S期卵裂球比率增至64%，M期卵裂球减少至9%；早、中、晚期桑葚胚的S期卵裂球比率分别是77%、72%和79%，M期卵裂球的比率分别是5%、3%和3%；早、中、晚期囊胚的S期卵裂球比率分别是78%、74%和77%，M期卵裂球的比率分别是4%、3%和4%。4℃的低温对小鼠早期胚胎的发育和DNA合成都没有明显影响；4-细胞、8-细胞胚胎和桑葚胚经低温处理及培养后其囊胚形成率和平均卵裂球数分别是62%和(26±6)个、54%和(25±7)个、87%和(34±8)个；4-细胞、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚经低温处理后S期卵裂球比率分别是97%、77%、70%和74%。