大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimA基因的克隆和序列比较分析

通过设计1对fimA全基因通用引物,对已知不同人、动物源的17株大肠埃希菌菌株的Ⅰ型菌毛fimA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并与GenBank中9株菌株序列进行同源性比较分析,探讨I型菌毛宿主嗜性。结果表明:17株菌株均能扩增出约549bp的预期大小目的片段。克隆和序列分析显示,26株不同来源的大肠埃希菌fimA基因的核苷酸同源性为88.7%~100%,推导氨基酸同源性为88%~100%,其中出现差异的31个易发生突变的位点多为中性氨基酸,其中10株菌的fimA序列于第26个氨基酸位置连续插入了脯氨酸和苏氨酸,且80%为猪源大肠埃希菌,因此提示I型菌毛在大肠埃希菌的进化过程中可能具备一定的宿主嗜性。     

F18+ETEC分离株的鉴定·菌毛蛋白提取及生物活性验证

[目的]探讨F18+ETEC分离株的鉴定、菌毛蛋白的提取及菌毛蛋白生物活性的初步验证。[方法]分别以分离株A20、D20为模板进行PCR扩增,用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。采用热抽提法分别提取F18标准株和分离株A20、D20的菌毛蛋白,并分别制备弗氏佐剂苗,免疫产蛋鸡,采用间接ELISA法定期检测母鸡的IgY和血清抗体效价。[结果]采用TSB培养基,37℃摇床培养24 h,分离株和标准株菌毛均获得了良好的表达。分离株A20、D20经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、SDS-PAGE方法鉴定均为F18+ETEC。F18ab分离株和标准株的菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄中IgY效价最高可达1∶25 600,血清中抗体效价高于卵黄中IgY效价,最高可达1∶51 200。[结论]分离株A20、D20均为F18+ETEC,且对产蛋鸡均具有良好的免疫原性。     

鸡源鲍氏志贺菌的RAPD分析

【目的】确定鸡源鲍氏志贺菌的进化地位。【方法】选用6条随机引物(P1~P6),采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对1株鸡源鲍氏志贺菌、2株鸡白痢沙门菌、2株鸡肠致病性大肠杆菌和2株痢疾志贺菌共7株菌的基因组DNA进行分析,同时对个别特殊序列进行克隆测序,并在此基础上分析了鸡源鲍氏志贺菌与其他15个相关菌株的进化关系。【结果】6条随机引物中有4条引物(P1,P2,P4和P6)能较好地在志贺菌、鸡白痢沙门氏菌和鸡致病性大肠杆菌3种菌中检测到多态性分子标记;这4条有效引物共扩增出了64个DNA片段,其中7个菌株共有的谱带有3条,多态性片段有61条,多态率达95.3%。引物P2可根据扩增图谱将志贺菌和大肠杆菌与沙门菌鉴别出来;用引物P6对上述7株细菌进行扩增,发现同种菌株间谱带特别相似,其中鸡鲍氏志贺菌与人痢疾志贺菌扩增条带的相同率达66.7%,与鸡肠致病性大肠杆菌扩增条带的相同率达44.4%,而鸡白痢沙门菌与志贺菌的扩增谱带相差甚远,可用于3种细菌的鉴别。对扩增片段进行的测序及进化分析结果显示,鸡源鲍氏志贺菌与人源志贺菌的进化距离最近。【结论】鸡源鲍氏志贺菌可能是人源志贺菌的一个变异株或新的亚种。     

鸡大肠杆菌FimH基因C端结构域克隆及特性分析

[目的]通过进一步研究禽大肠杆菌I型菌毛主要结构基因FimH的基因结构及其抗原特性,为深入探索鸡大肠杆菌致病机理及研制基因工程疫苗奠定必要的理论基础。[方法]本文以已发表的Fim H基因C端核酸序列为参考序列,设计并合成引物,扩增鸡大肠杆菌JS1、JS2、JS6三个菌株的Fim H相应基因,使用Lasergene软件对其进行序列比对、蛋白质结构预测以及进化树的绘制等。[结果]JS1、JS2、JS6三个菌株的核酸同源性分别为97.3%、97.7%和97.3%,而氨基酸序列的相似性分别为95.3%、97.6%和95.3%。此外,其抗原决定簇基本相似,但在第78和79位抗原决定簇不同,这说明本研究中的3个鸡大肠杆菌菌株的Fim H基因序列及氨基酸序列的变异可能对Fim H蛋白抗原结构产生了轻微影响。进化树分析发现,本实验室分离的3株鸡大肠杆菌菌株FimH基因与选择的国内鸡大肠杆菌菌株的Fim H基因同源性比较高,同处于一个进化分支中。[结论]本研究结果表明鸡大肠杆菌I型菌毛Fim H基因未发生明显变异,这为后续研究Fim H基因的功能及其基因工程亚单位疫苗研发提供了重要的实验基础。     

不同来源的5株新城疫病毒的分离·鉴定与基因型分析

[目的]分离鉴定不同来源的5株新城疫病毒（NDV）,并对其基因型进行分析。[方法]从江苏和广西发病孔雀、鸡、鹅群分离到5株NDV。参照文献合成1对引物P1和P2,用于扩增基质蛋白基因（M）1161nt至融合蛋白基因（F）889nt之间长约970nt的片段。用TrizolRNA试剂盒抽提5株NDV基因组,再按照Promega说明书,用上游引物P1合成F基因cDNA,合成的cDNA作为聚合酶链式反应（PCR）的扩增模板,用PCR反应扩增F基因目的片段。将所得产物进行序列测定,获得这5株NDVF基因5′端约890nt序列。采用DNAMAN软件对F基因47～420nt间的片段进行序列分析,并推导出相应的氨基酸序列。在此基础上,从GenBank中选取32个参考毒株与这5个分离株进行遗传变异分析,并绘制系统发育进化树。[结果]同源性分析比较表明,5株NDV分离株之间的差异性很小,它们之间的同源性为95.00%～97.00%,其中2株广西分离株之间的同源性为97.07%,3株鹅源分离株之间的同源性为96.43%。所有毒株F蛋白裂解区氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株裂解区位点特征。这5株NDV分离株均属于基因Ⅶ型和Ⅶd亚型。[结论]近几年流行的NDV的主导基因型为基因Ⅶ型,且来自不同宿主的毒株之间的差异性较小。     

黑曲霉中国株(3.758)葡萄糖氧化酶(GOD)基因的克隆与结构分析

[目的]为充分开发黑曲霉在轻工业中的用途。[方法]以黑曲霉中国株(3.758)基因组DNA为模板,用LATaqDNA聚合酶对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,扩增片段纯化后与pUCm-T载体连接后,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,经琼脂糖凝胶电泳法、酶切和PCR鉴定获得阳性克隆。对获得含GOD基因的克隆进行测序,分析其蛋白质氨基酸序列及限制性内切酶的图谱。[结果]经PCR扩增获得约1.8kb的片段。获得的GOD基因编码序列共1818bp,与报道的黑曲霉(ATCC9029)GOD基因序列仅有3个碱基之差。该基因序列具有多个限制性内切酶位点。黑曲霉不同菌株与中国株(3.758)GOD基因的同源性比较表明,不同黑曲霉菌株中GOD基因不同,而菌株ATCC9029与菌株NRRL-3是同一菌株。[结论]该研究获得了GOD基因的全长序列,为GOD的生物工程生产和相关植物基因工程奠定了基础。     

禽6型副粘病毒JL-127株的分离与鉴定及其毒力基因序列分析

[目的]研究禽6型副粘病毒生物学特性.[方法]从来自吉林省自然保护区的野鸭拭子中分离出1株禽6型副粘病毒（Avian paramyxovirus type 6,APMV6）,进行了形态学、血清学、生物学和病毒分子生物学鉴定,测定该病毒全基因组序列,并对F和HN毒力基因进行进化分析.[结果]成功分离鉴定出1株APMV6,命名为JL-127,基因组全长为16 236 nt,毒力基因进化结果表明,JL-127株与TW及FE株遗传关系较近,与HK株遗传关系较远.[结论]首次对我国野鸭源APMV6分离株进行全基因组测序,并对其进行遗传进化分析.     

鸡大肠杆菌毒力因子的流行病学及药物敏感性分析

采集江苏省不同地区15个鸡场的疑似大肠杆菌感染病例的病料,通过细菌学分离鉴定,共获得45株大肠杆菌,并确定了O78(53.33%)和O109(28.89%)为优势O抗原型。根据Pap菌毛基因设计1对引物,根据文献报道合成2对引物,分别用于Pap菌毛、F1菌毛以及毒力岛HPI的基因检测;通过对45株大肠杆菌分离株的PCR扩增,确定了7株(15.56%)为F1+大肠杆菌,1株(2.22%)为F1+Pap+大肠杆菌,22株(48.89%)为F1+HPI+大肠杆菌,4株(8.89%)为F1+Pap+HPI+大肠杆菌,5株(11.11%)为HPI+大肠杆菌,未发现Pap+菌株。选用7种临床常用的抗菌药对全部菌株进行药敏试验,结果表明:绝大多菌株对呋喃妥因、头孢唑林、多黏菌素B敏感,对环丙沙星和庆大霉素因菌株差异而异,林可霉素、四环素多不敏感。     

1株抗肿瘤新城疫病毒的毒力分析

[目的]分析1株抗肿瘤新城疫病毒(NDV)的毒力。[方法]通过传统毒力的测定方法,测定此株NDV的最小致死量的平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及静脉致病指数(IVPI)。通过RT-PCR扩增此株病毒基因组的多个片段,相邻扩增片段之间有部分核酸序列重叠且覆盖完整的融合蛋白(F)基因和血凝素神经氨酸酶(HN)基因的区域,并进行测序。[结果]此株NDV的MDT为105.6h,ICPI约为0.26,IVPI为0。测序结果表明,此株病毒是1株新的NDV,其F蛋白剪切位点为112RRQRRF117。[结论]此株NDV为弱毒株,其F蛋白剪切位点与强毒株一致。除F蛋白剪切位点外,NDV的毒力必然与其他因素相关。     

10株镰刀菌rDNA内转录间隔区(ITS)序列分析

[目的]探索镰刀菌菌株间的系统发育关系。[方法]采用氯化苄法从分离的10株镰刀菌菌株中提取基因组DNA,对其内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增和序列测定。采用Blast方法将测序结果在GenBank中进行同源搜索,采用邻接法构建其与相关菌株的ITS序列系统发育树。[结果]供试菌株分别位于系统发育树的3个分支上,7株与腐皮镰刀菌为一个分支,序列相似性为98.61%~100%。菌株F94与尖孢镰刀菌为另一个分支,序列相似性为100%。菌株F83和F97与Fusarium incarnatum为另一个分支。各分枝内序列相似性均较高,为97.61%~100%,而不同分枝间菌株序列相似性较低。[结论]ITS序列系统发育分析可为镰刀菌属种的鉴定提供参考依据。     

江苏杨梅部分品种的ISSR分析

[目的]研究江苏地区杨梅(Myrica rubra Bieb.et Zucc)的亲缘关系。[方法]用ISSR-PCR方法对18个江苏地区杨梅品种(系)进行分析,并用UPGMA法构建分子系统树。[结果]筛选出的9个引物共扩增出70个DNA片段,其中多态性片段43个,占扩增总片段的61.4%;所分析的18个杨梅品种(系)在遗传距离0.14处分为6组,说明江苏杨梅在基因交流的基础上,有局部隔离。[结论]为杨梅种质资源的保护、利用及新品种的培育提供了科学依据。     

猪源ETEC的黏附素基因克隆与原核表达

[目的]克服传统方法制备黏附素抗原的缺点。[方法]应用PCR对猪源性产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的黏附素F4、F5和F6的质粒中扩增出faeG、fanC和fasG基因片段,克隆测序并与pET 32a(+)构建重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli表达菌株BL21(DE3),并分析其免疫原性。[结果]重组表达载体经IPTG诱导获得高效表达。血凝抑制试验表明,鼠抗血清能抑制标准的ETEC强毒株凝集红细胞,抑制效价在1∶128以上。这说明克隆表达的猪源ETEC黏附素蛋白具有良好的免疫原性。[结论]该研究可为进一步开发抗体制剂奠定基础。     

基因群体遗传多态性检测方法的比较研究

[目的]寻找基因的群体遗传多态性检测的理想方法,为基因突变的群体检测提供方法指导。[方法]以104头中国荷斯坦牛群为研究对象,扩增了牛TLR4基因243 bp特异性片段,分别采用SSCP和创造酶切位点的RFLP(CRS-RFLP)方法检测了扩增片段的第27 bp处C→T的突变,并对其方法进行了比较分析。[结果]结果表明,在104头个体的扩增片段中,SSCP未能检测出多态性,而CRS-RFLP方法检测出了多态性。[结论]在不能直接采用RFLP方法的情况下,与SSCP相比,创造酶切位点RFLP(CRS-RFLP)方法为群体多态性检测的理想选择。     

泰山螭霖鱼线粒体COⅠ基因序列的遗传多样性分析

[目的]通过克隆泰山螭霖鱼的COⅠ基因序列,研究其与鲤科几属鱼类的进化关系,确定泰山螭霖鱼的分类地位。[方法]以泰山螭霖鱼30个个体为材料,对其线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)的部分序列进行PCR扩增和序列对比,检测泰山螭霖鱼的遗传多样性;计算泰山螭霖鱼不同单倍型与Gen Bank中鲤科5个属鱼类的遗传距离,采用聚类分析方法,构建NJ和UPGMA系统进化树。[结果]30个个体泰山螭霖鱼线粒体COⅠ基因片段长度约1 600 bp,无碱基的插入和缺失,纯化并去除引物序列后获得约1 493 bp的核苷酸序列,存在6种单倍型,共检测到6个多态位点,包括4个转化、2个颠换,其单倍型多样性(Hd)为0.460,核苷酸多样性(Pi)为0.000 78,平均核苷酸差异数(K)1.163。遗传距离和NJ和UPGMA系统进化树表明,泰山螭霖鱼与多鳞白甲鱼的COⅠ序列一致,泰山螭霖鱼所在的突吻鱼属与光唇鱼属的亲缘关系最近,与金线鲃属、倒刺鲃属、华鲮属的亲缘关系较远。[结论]该研究为其种质资源的管理与保护及遗传育种提供分子生物学依据。     

烟台威海沿海菲律宾蛤仔线粒体遗传多样性分析

[目的]了解我国沿海野生菲律宾蛤仔群体遗传多样性和遗传分化情况。[方法]采用PCR技术对烟台威海2个群体的线粒体COⅠ基因片段进行扩增和序列分析。[结果]50个样本均得到684 bp的COⅠ基因片段序列,共定义了42个单倍型,检测到62个变异位点,2个群体单倍型多样性都较高,而核苷酸多样性相对偏低。用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)构建的单倍型系统进化树显示2个地理种群的样本呈现散在分布,无明显的种群分化。[结论]反映了海洋动物的基因交流较容易,不同海域隔离较弱。     

一株高产脂肪酶产生菌16S rDNA的序列分析

[目的]对分离获得的高产脂肪酶菌株进行鉴定,为其改造和更好利用奠定基础.[方法]对从食堂下水道中分离获得的一株高效产脂肪酶细菌(JLΠ-4)进行培养,提取其基因组DNA.设计16S rDNA通用引物,扩增16S rDNA基因片段,并连接到pUC19-T载体上,转化大肠杆菌DH5X,经PCR鉴定的阳性克隆摇菌培养后测序.[结果]提取获得较高质量的基因组DNA,扩增获得新分离菌株16S rDNA基因片段,长度为1528 bp,BLAST相似性比对分析结果表明,其与伯克霍尔德氏菌16S rDNA序列相似性达97%,是一株与伯克霍尔德氏菌最近的革兰氏阴性菌.[结论]初步将高产脂肪酶细菌JTΠ-4鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌.     

马源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

[目的]了解广西马源Ⅰ型副粘病毒的生物特性,为今后有效防控副粘病毒在不同宿主间传播提供科学依据.[方法]用SPF鸡胚对广西百色疑似病马组织悬浮液进行病原分离培养后,经血清学试验和致病性试验鉴定,再用RT-PCR对分离株F基因进行扩增,并对扩增片段进行测序分析.[结果]分离获得的病毒能使鸡红细胞发生凝集,且这种凝集可被鸡新城疫（ND）标准阳性血清所抑制,HA和HI效价分别为27和210.分离株毒力试验结果显示,鸡胚平均死亡时间（MDT）为72 h,雏鸡脑内接种致死指数（ICPI）为1.48,属中发型毒株.分离株与禽Ⅰ型副粘病毒基因Ⅶ型毒株NDV04-21、TW-96p的核苷酸同源性分别为95.9％和95.1％;基于F基因的遗传分型进化树显示,分离株与NDV04-21、TW-96p处于同一进化树分支,属于禽Ⅰ型副粘病毒基因Ⅶ型;分离株F蛋白112～117裂解位点氨基酸序列与标准强毒株F48E9、HER33的一致,在第112～117位氨基酸序列为3＇-R-R-Q-R-R-F-5＇.[结论]广西马群已有禽Ⅰ型副粘病毒存在,再次证实广西地区禽Ⅰ型副粘病毒宿主范围在不断扩大.     

北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因克隆与遗传演化分析

【目的】研究2014年新疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）遗传变异情况,监测PRRSV在新疆流行情况,为新疆的PRRSV血清学检测提供帮助。【方法】采用RT－PCR方法对分离自新疆地区的PRRS疑似病料进行ORF7基因扩增和测序,分析PRRSV ORF7基因变异情况。【结果】检测到18株PRRSV毒株具有ORF7碱基突变,均属北美洲型,与国外的参考毒株和国内的参考毒株有着不同的亲缘关系。其中,XJzx4、XJzx12与国外的参考毒株01NP1.2、PA8、VR－2332、LMY亲缘关系较近。除XJzx1、XJzx14外,其余毒株与内地毒株BJsy06、GD、HB－1 sh2002、HuN、JXA1、LN、NX06、SX2009亲缘关系较近,推断由内地毒株演化而来。【结论】新疆本地流行猪繁殖与呼吸综合征毒株是来自国内外不同地区毒株,ORF7基因在新疆具有不同的遗传变异类型。没有检测到新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因有缺失型突变。     

利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。