苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry2Ac4基因;笔者以含有BtWB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPFG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达.     

中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达

通过双酶切、连接转化等方法将中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(NT3GT)基因克隆到原核表达载体pET29a上,构建原核表达重组质粒pET29a-NT3GT。重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,NT3GT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为55kDa。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为NT3GT抗血清的制备及功能分析奠定基础。     

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。     

新城疫病毒F蛋白结构域基因原核表达与抗原表位分析

以含新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因的重组质粒为模板,设计特异引物进行重叠-延伸PCR扩增获得F基因的抗原结构域基因片段Fa、Fb和Fa-l-Fb,经SalⅠ和NotⅠ酶切后,定向插入原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-Fa、pGEX-Fb和pGEX-Fa-l-Fb;用定点突变方法获得重组质粒pGEX-Fa-mut.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,转化菌经IPTG诱导、提取表达产物进行蛋白电泳和免疫印迹分析.结果表明:Fa-mut、Fb和Fa-l-Fb结构域基因均获得了融合表达,表达产物与NDV阳性血清具有免疫反应性;与pGEX-Fa-mut不同,pGEX-Fa重组质粒在大肠杆菌中未能表达,且转化菌在IPTG诱导过程中未见生长,提示未经突变的Fa片段可能为毒性蛋白.三维结构预测结果显示,目的蛋白片段中均保留F蛋白中原有相应的抗原表位.     

牛肌生成抑制素基因全序列的克隆及原核表达

根据GenBank上发表的牛肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,利用RT-PCR技术,以牛肌细胞总RNA为模板,对牛的肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列进行扩增.经酶切鉴定、DNA测序和氨基酸序列分析证实MSTN基因克隆成功.从pMD18T-MSTN克隆中获得MSTN编码序列,将其与pET32a( )质粒连接,构建pET32a( )-MSTN重组质粒,重组菌经IPTG诱导在大肠杆菌中表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的,SDS-PAGE特异区带分子量为60 ku.     

K88 ad ETEC菌毛蛋白亚基基因faeC的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为研究毒素源性大肠杆菌(ETEC)菌毛蛋白分子装配机理,从K88 ad ETEC中PCR扩增出K88菌毛蛋白小亚基基因片段facC,然后将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a( )中,获得重组质粒pET30C,并将该质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中;重组菌株经IPTG诱导后,经过SDS-PAGE分析表明该菌株可以表达FaeC蛋白(16.9kDa),且重组蛋白主要以包涵体形式存在,约占菌体蛋白的30％。用分离纯化的重组FaeC蛋白免疫小鼠,获得FaeC的鼠抗血清,经免疫学分析表明,利用此重组蛋白制备的抗血清与FaeC重组蛋白及K88 ad ETEC的菌毛蛋白都能发生特异性抗原-抗体反应。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达

以EGFP为标记基因,原核表达质粒pGEX-4T-1为载体,成功构建重组质粒pGEX-4T-EGFP,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG进行诱导表达,通过紫外照射和SDS-PAGE检测其在大肠杆菌中的表达情况,为原核表达系统提供新的报告基因和筛选标记。     

大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达

对大肠杆菌的外膜蛋白A基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达,为大肠杆菌重组疫苗的构建奠定基础.以大肠杆菌分离株308-2菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因ompA进行扩增,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pET32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主E coli Ros...     

苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

AFL1基因是苹果控制花发育的关键基因之一。在已得到AFL1 cDNA基因的基础上,将AFL1克隆到原核表达载体pET28b中,获得了重组表达质粒pET-AFL1,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳分析,结果显示,AFL1基因在大肠杆菌中成功表达,表达的AFL1融合蛋白分子量大约为53 kD。     

猪白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达及其生物学活性测定

【目的】在大肠杆菌中表达猪白细胞介素-2(pIL2),并鉴定其生物学活性。【方法】以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增IL-2基因。将猪IL-2基因定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-pIL2,并应用甲基噻唑基四唑(MTT)试验测定融合蛋白的生物学活性。【结果】以含有猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增出1条约420bp的带。所获重组质粒pGEX-pIL2经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。SDS-PAGE电泳结果显示,可检测到相对分子质量约为42ku的GST-pIL2,Western-blot证实GST-pIL2能与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应。表达蛋白经薄层层析扫描分析,表达量约占菌体总蛋白的40%。MTT试验证实,表达产物经变性、复性后能极显著促进猪脾淋巴细胞增殖。【结论】猪IL-2基因在大肠杆菌中得到表达,表达的蛋白具有一定的生物学活性。