草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的初步表达

根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建

以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。     

半滑舌鳎生长激素及其受体基因的原核表达

根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSGHR1-2质粒在70 kD处发现诱导的蛋白条带,其表达量分别占细胞蛋白总量的37.6%和20.2%;而构建的pGEX-6P-1-CSGH重组质粒和含有GHR-Ⅰ基因跨膜区的重组质粒(pET-32a-CSGHR1-1、pET-32a-CSGHR1-2和pGEX-6P-1-CSGHR1-1)均未获得表达产物。由此可见,半滑舌鳎GHR-Ⅰ基因的跨膜区可能影响其在大肠杆菌中的表达。研究结果为实现半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ制剂的开发及应用于养殖生产实践奠定基础。     

新城疫病毒分离株融合蛋白基因的遗传变异分析

根据GenBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对所分离的LN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GenBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.1%～98.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.1%～99.5%之间。     

刺参甘露糖结合凝集素的原核表达、纯化及生物活性分析

为进一步研究刺参甘露糖结合凝集素(AJ-MBL)的功能及提高刺参自身免疫力,对AJ-MBL基因的CDS区进行原核表达、纯化并初步鉴定其生物学活性。采用RT-PCR法扩增AJ-MBL基因编码区,经酶切鉴定、序列分析后,将其CDS区498 bp片段克隆至原核表达载体pET28a中,得到重组质粒pET-AJ-MBL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并经IPTG诱导表达出分子量约17 ku的融合蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,用Ni²⁺离子亲和柱纯化。结果显示,获得高表达量的重组纯化蛋白。纯化的17 ku AJ-MBL进行红细胞凝集试验检测其生物学活性。凝集试验结果显示,AJ-MBL凝集最小浓度为10 μg/mL。本实验成功构建了AJ-MBL原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了17 ku AJ-MBL蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性。     

斑点叉尾鮰病毒“自杀性”DNA疫苗的构建及其体外表达检测

根据CCVORF6基因序列,设计合适的引物,扩增ORF6基因,分别将其克隆到自杀性DNA疫苗载体pS-FV与常规DNA疫苗载体pcDNA3.1(+)中,转化感受态细胞DH5α后提取质粒,构建斑点叉尾鮰(Ictalurus punc-tatus)自杀性DNA疫苗ps-ORF6与常规DNA疫苗pcd-ORF6,利用转化后的大肠杆菌菌液为模板进行PCR扩增、提取质粒酶切鉴定以及序列测定等方法证实重组质粒构建正确。将重组质粒转染人胚肾细胞(293T),间接免疫荧光试验表明ORF6均获得表达,但自杀性DNA疫苗的表达效果不如常规DNA疫苗,该研究为这2种疫苗进一步的鱼体试验奠定了基础。     

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因表达和间接ELISA检测方法的初步建立

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,数量居海洋类弧菌之首,其快速检测具有重要意义。以溶藻弧菌国内标准株ATCC17749基因组DNA为模板,PCR扩增出外膜蛋白OmpK基因,将其克隆入表达载体pET-28a中,获得重组质粒pET-28a-OmpK,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列开放读码框正确且与已发表的OmpK结构编码序列完全一致。将重组质粒pET-28a-OmpK转化大肠杆菌BL21 pLys E,高效表达重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠所得的高免血清能外膜蛋白OmpK特异性结合,表明体外表达的重组蛋白OmpK具有良好的免疫原性和反应原性。利用该抗溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的抗血清建立了间接ELISA检测方法,检测灵敏度为10⁴ CFU/mL,能特异性检测出溶藻弧菌,与其他菌株无交叉反应。     

三疣梭子蟹C-型凝集素的原核表达和活性检测

通过RT-PCR扩增三疣梭子蟹C-型凝集素（C-type lectin like-domain protein,CTLD）基因序列,将目的基因克隆入质粒pET32a,构建原核表达重组质粒pET32a-CTLD.将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导CTLD的表达,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot 检测.用His GraviTrap Ni亲和层析柱及超滤离心管纯化目的蛋白,并对其进行活性检验.结果表明,构建得到CTLD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;诱导表达出相对分子质量（M） 39 600的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达;重组C-型凝集素对兔的红细胞没有明显的凝集作用,但对小鼠红细胞的凝集效价是22,而对所选5种细菌的凝集作用存在差异,其中对大肠杆菌具有明显的凝集作用,而对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和金黄色葡萄球菌均无凝集现象.本研究结果为进一步研究C-型凝集素在免疫防御中的作用与地位提供依据.     

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达

根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物，应用聚合酶链式反应（PCR）方法，从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEM-Teasy载体，测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列，定向克隆到原核表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒pGEX-4T-OmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GST-OmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Western-blotting分析表明，它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应，提示外膜蛋白OmpK可能是哈维氏弧菌的重要保护性抗原之一。     

大银鱼卵巢的成熟期和产卵类型

本文对崇明长江口及金山沿海大银鱼的卵巢进行了周年的组织学观察，将大银鱼的卵巢发育划分为六期，还有重复发育的Ⅵ-Ⅲ′期(或Ⅲ′期)、Ⅳ′期和Ⅴ′期。在生殖时期，至少产二次卵，属多次产卵类型。产卵时间从12月底开始，一直延续到翌年4月。产完卵后鱼体消瘦，不久死亡，寿命仅一年。     

新海洋法与世界渔业的发展趋势

一、新海洋法中的渔业规则 (一)1982年海洋法公约中的渔业规则在国际法中的地位 联合国第三次海洋法会议于1978年底召开,经过长期协商,于1982年4月23日通过了《海洋法公约》,公约于1982年12月10日开始签字,有119个国家立即签了字。到1985年11月为止,共有159     

河蚌外套膜的组织培养

本文报道了褶纹冠蚌和背角无齿蚌外套膜的组织培养结果。试验表明，河蚌外套膜的上皮细胞和结缔组织的成纤维细胞能在离体培养条件下生长繁殖。在试验中还能观察到所培养的组织块上皮细胞，能分泌出茶褐色的有机珍珠质，使组织块逐渐变成茶褐色。     

四片式中层拖网主要部件尺寸变化对其性能的影响

通过拖网系列模型水池试验，研究四片式中层拖网网衣主要部件尺寸变化对网具性能的影响，试验结果表明：（１）因侧网宽度变化对扫海面积影响的规律是侧网密度越小，扫海面积越大，在拖速３．５￣５．０ｋｎｏｔ的范围内，扫海面积随着网袖长度的增长而增大；当其比值大于３０．９３６％以后，扫海面积随着网袖长度的增长而减小，网袖长度对网具阻力影响的趋势是网袖长度越长网具阻力越大，（３）网身长度与网口拉直长度之比为２５．     

书讯

上海水产大学王素娼教授主编的《中国经济海藻超微结构的研究》一书即将由浙江科学技术出版社出版。全书的主体由120版约360幅图片和约12万字的文字论述组成。该书中研究的对象主要分三类:第一类为中国主要的养殖种类如海带、紫莱、裙带菜、江蓠、石花菜;第二类为经济海藻或者是中国特产的种类,如鹿角菜等;第三类为常见种或引进种     

西湖水库大银鱼胚胎发育的初步观察

对人工授精大银鱼卵的胚胎发育的观察表明:在水温7±1℃条件下,大银鱼胚胎发育历时894h。仔鱼孵出6—8d后卵黄囊消失,进入外源性营养阶段。非受精卵发育到原肠期死亡,原肠晚期是计算受精率的可靠时间。     

EDTA对紫彩血蛤幼虫发育的影响

本文研究了ＥＤＴＡ对紫彩血蛤幼虫生长,存活和变态的影响。结果表明,所有试验的ＥＤＴＡ浓度均能促进幼虫生长,前期３．０×１０＾－６浓度组生长最快,幼虫平均壳长由对照组的２３５．６μｍ增至２３９．７μｍ,后期则以１．０×１０＾－６浓度且生长最快,幼虫平均壳长由对照组的２４７．４μｍ增至２５３．０μｍ;０．５×１０＾－６－５．０×１０＾－６ＥＤＴＡ均能提高幼虫的存活率和变态率,其中以１．０×１０＾－６效