抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其特性的研究

本实验将鸡传染性支气管炎病毒（澳大利亚Ｔ株）进行纯化,制成抗原,应用杂交瘤技术建立了５株分泌抗鸡传染性支气管炎病毒的杂交瘤细胞株,其免疫球蛋白的亚类分别属于ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＭ。杂交瘤细胞分泌抗体的能力稳定,长期传代对其抗体分泌能力没有影响。５株单克隆抗体与其它１２株鸡传染性支气管炎病毒标准株之间存在不同程度的交叉反应,但对鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、产蛋下降综合征病毒及禽流感病毒均无交叉反应。用此杂交瘤细胞制备腹水的ＥＬＩＳＡ效价为１０－６～１０－７,抗体对热的稳定性有一定的差别。抗体纯化后,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳表明具有单克隆抗体的特征,经快速蛋白分析鉴定其纯度为８９．４９％。竞争ＥＬＩＳＡ法证明其中４株的单抗与抗原结合位点并不完全相同。采用单抗夹心ＥＬＩＳＡ法,对抗原的检测方法进行了初步探索。     

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因免疫的研究

将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒ＨＢ株的核蛋白基因亚克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的Ｋｐｎｌ酶切位点。快速筛选鉴定出含有ＨＢ核蛋白基因的重组质粒，经酶切、ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定为正向插入的重组ＨＢ核蛋白基因后，将其命名为ｐｃＤＮＡ－Ｎ。对重组质粒ｐｃＤＮＡ－Ｎ进行大量扩增，应用聚乙二醇方法进行纯化，将纯化后的 ｐｃＤＮＡ－Ｎ按 １００／只免疫１４日龄雏鸡，并以ＰＢＳ免疫作为空白艰照。免疫后的攻毒试验结果表明，在基因免疫组的１０只雏鸡中，有４只雏鸡存活，保护率为４０％（４／１０）；而空白对照组的１０只雏鸡则全部死亡，无保护率。本试验认为，ＩＢＶ核蛋白在抗感染和致死方面起着一定的免疫保护作用。     

单克隆抗体在鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究中的应用

单克隆抗体在鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究中的应用朱建国（郑州牧业工程高等专科学校医药系，４５００４５）刘秀梵（扬州大学农学院）鸡传染性支气管炎（ＩＢ），是由传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染的呼吸道疾病，以气管罗音、...     

抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体的构建及初步鉴定

为了构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(N)单链抗体(scFv),本研究通过提取杂交瘤细胞株6H3的总mRNA,采用RT-PCR法扩增出抗IBV N蛋白抗体的重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将其重链和轻链通过一条寡核苷酸链连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组质粒,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.对表达产物进行纯化复性后,用夹心ELISA和western blot检测表明scFv可与传染性支气管炎病毒核蛋白发生特异性结合.     

抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为建立抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的单克隆抗体(MAb),利用浓缩的IBV致弱株CK/CH/LDL97Ⅰ F115病毒免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA和有限稀释法,经筛选和克隆后获得了一株抗IBV N蛋白MAb的杂交瘤细胞系(2D2).经鉴定,其MAb的重链为lgG<.1>亚型,轻链为κ链.ELISA和westernblot试验结果表明,所获得的这株2D2 MAb可特异性识别IBV N蛋白.2D2 MAb可与多种血清型IBV发生反应,表明该MAb识别的表位可能位于N蛋白的保守区域.为进一步鉴定IBV的表位及诊断试剂的研究奠定了基础.     

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株核蛋白基因的克隆与序列分析

本研究参考已发表的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因序列，设计了一对核蛋白基因的特异性引物NP5、6，经RT-PCR扩增得到了IBV国内分离株DB株、XJ株、DC株、HD株的1199bp的核蛋白基因片段，并进行了克隆和序列测定。将4个国内分离株核蛋白基因的序列与国外发表的参考毒株的核蛋白基因序列进行了比较和分析，结果显示这4个毒株与澳大利亚群的参考毒株亲缘关系最为密切，核苷酸序列同源性86%-91%。其中DC株发生了较大程度的变异。国内分离株核蛋白基因核苷酸的变异引起了蛋白质二级结构的部分改变。     

禽传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研究

禽传染性支气管炎云分离株,经鸡胚增殖、密度梯度离心提纯后,制成佐剂抗原,免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,应用ＥＬＩＳＡ监测小鼠地ＩＢＶ的应答能力。在ＰＥＧ－６０００（聚乙二醇）的作用下,小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。对分泌抗体阳性较强的杂交瘤细胞。应用有限稀释法克隆３次以上。获得９株抗ＩＢＶ阳性杂交瘤细胞,其中７株能稳定分泌抗ＩＢＶ单克隆抗体。初步应用研究表明,该７株杂交瘤细胞所和的单克隆抗体,不但能区分ＩＢ     

禽传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其B细胞抗原表位的鉴定

为鉴定传染性支气管炎病毒(IBV)的抗原表位,本研究将IBV ck/CH/LDL/091022株免疫6周龄～8周龄BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经过有限稀释法克隆筛选,得到一株针对IBV核衣壳(N)蛋白的单克隆抗体(MAb)2F2,经鉴定其染色体数目为101条,MAb亚类鉴定其重链属于IgG1,轻链属于K链.用肽扫描方法将IBV ck/CH/LDL/091022株N基因截短为具有相互部分重叠的23段,表达带GST标签的重组蛋白,与MAb 2F2进行western blot和ELISA反应后,鉴定其表位为397INWGDSAL404.将表位序列进行Blast结果表明,本研究鉴定的表位在大部分IBV株中均为保守抗原表位,为进一步建立IBV的检测方法奠定了基础.     

鸡传染性支气管炎病毒DB株核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达

利用PT－PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒（IBV）DB株的核蛋白基因，并对其序列进行了测定，DB株IBV的核蛋白基因长度为1230bp，编码蛋白由409个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较，发现DB株与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。同时构建了杆状病毒重组转移载体pBlue-DB-N，将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞，经过3轮蚀斑纯化和聚合酶链式反应（PCR）鉴定，获得重组杆状病毒rBac-DB－N。SDS－PAGE分析和Western blot检测的结果表明DB株IBV核蛋白基因基因在重组杆状病毒感染原Sf9昆虫细胞内获得表达，融合蛋白最大表达量占细胞蛋白总量的19．4％左右。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用RT-PCR扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白基因并克隆至原核表达载体pET-28a,转化到宿主表达菌BL21后经IPTG诱导表达和Ni柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组N蛋白,其大小约为58 ku。将纯化重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合,PEDV间接ELISA方法筛选,制备获得4株能稳定分泌PEDV抗体的杂交瘤细胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和间接免疫荧光试验证明其与PEDV均有特异性反应,单抗亚类鉴定均属于IgG1,轻链为κ型。杂交瘤细胞培养上清ELISA抗体效价为1∶1 600~6 400,腹水ELISA抗体效价达1∶1.024×105以上;4株细胞连续培养20代,其ELISA抗体效价基本一致。本研究为PEDV感染的诊断和致病机制研究提供了有用工具。     

抗禽流感病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析

为制备抗禽流感病毒(AIV)NS1蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位鉴定,本研究以原核表达并纯化的NS1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,制备的D7和D9 2株能够稳定分泌抗NS1蛋白MAb的杂交瘤细胞,亚型鉴定均为IgG1型,轻链均为k链.Western blot鉴定表明,这2株MAbs均能够识别NS1重组蛋白.间接免疫荧光鉴定表明,这2株MAbs均能够识别真核表达的NS1蛋白.利用噬菌体展示技术得到D9对应的短肽WNLNTV,与NS1蛋白aa 182～aa 187基本匹配,提示182WNDNTV187为NS1蛋白的一个线性表位.该结果为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础.     

鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其B细胞表位的鉴定

为鉴定传染性支气管炎病毒(IBV)B细胞抗原表位,本研究将IBV致弱株CK/CH/LDL97Ⅰ病毒与重组N蛋白作为免疫原,交叉免疫BALB/c小鼠,制备了1株抗IBV N蛋白的单克隆抗体(MAb)6D10。Westernblot结果表明该MAb可特异性的识别IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株和重组N蛋白。同时利用噬菌体展示技术对IBV N蛋白抗原表位进行筛选,获得11个阳性噬菌体克隆。序列分析表明,这11个克隆均展示有"FGPRTK"6个氨基酸的序列,对应于IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株N蛋白242位～247位氨基酸残基。同时,通过人工合成其编码序列并进行原核表达,利用MAb6D10对表达产物进行western blot分析,反应性良好。由此表明"FGPRTK"6肽为IBV CK/CH/LDL97Ⅰ株的一个线性B细胞抗原表位。表位的保守性分析结果表明,本研究鉴定的表位在各种血清型IBV毒株中均高度保守。本研究结果为进一步研究IBV N蛋白抗原的结构和功能及诊断试剂的研发奠定了基础。     

鸭肝炎病毒单克隆抗体的研制

以反复冻融、氯仿处理、滤膜过滤、PEG反透析浓缩和分子筛层析的方法纯化DHV免疫BALB／c小鼠，同时作为包被抗原建立了筛选抗DHV阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA方法，经特异性和重复性试验，效果良好。经一系列融合、筛选，成功获得阳性杂交瘤细胞株4株，并制备出了腹水，分别命名为285、2E8、5E6和6C11。特性鉴定结果表明4株单抗ELISA效价均比较高且特异性好，中和特性稍差，和两株Ⅰ型标准毒以及在山东分离到的几株病毒均有交叉反应。     

抗犬瘟热病毒重组核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组犬瘟热病毒(CDV)N蛋白免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术获得两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为A_4C_6C_(12)和A_5B_8H_7。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10~6、1:10~5;亚类鉴定结果分别为IgG2a、IgG2b,轻链均为κ型;Western blot和ELISA分析结果显示2株单克隆抗体均能与重组N蛋白和CDV发生反应,而与犬细小病毒及犬腺病毒等无交叉反应;ELISA叠加试验的增值结果表明两株单克隆抗体识别的抗原位点不同。特异性抗CDV-rN的单克隆抗体的获得,为进一步用于临床诊断研究奠定了基础。     

一株抗猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备抗猪脑心肌炎病毒(EMCV)HB10株VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达系统表达的重组VP2蛋白(r VP2),纯化后将其免疫BALB/c小鼠,取免疫的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出一株稳定分泌抗VP2 MAb(1D3)。通过间接免疫荧光试验和western blot对该MAb的免疫活性和特异性进行鉴定,结果表明1D3 MAb仅能够特异性与EMCV全病毒反应。此外,通过构建截短的VP2蛋白重组质粒,采用western blot的方法对VP2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 1D3识别的线性表位区域为89DGGVFGAALRRH100。本实验结果为进一步研究VP2蛋白的功能及建立EMCV检测方法奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株gE和gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗免疫抗体与病毒感染抗体鉴别诊断方法,分别以PRV变异毒株的gE或gB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选所需单克隆抗体,获得6株抗PRV gE蛋白的单抗(3E6、7E1、7C5、10C3、15C1、14C1)和6株抗PRV gB蛋白的单抗(1C1、5D2、2F11、5G8、10C7、8H5)。IPMA检测结果显示,gE蛋白单抗能识别PRV变异毒株,但不识别疫苗株;而gB蛋白单抗可同时识别PRV变异毒株和疫苗株。gE单抗10C3和gB单抗10C7的ELISA效价和IPMA效价均分别达1∶5×10~(5.0)和1∶8×10~(3.0)以上。所筛选出的单抗均不与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)等其他常见病毒发生交叉反应。gE蛋白和gB蛋白的表达及单抗的制备为PRV感染抗体与疫苗免疫抗体鉴别诊断(DIVA)试纸的研发奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的重组PEDVN蛋白为抗原免疫7周龄雌性BALB／c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了7株稳定分泌抗重组N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为9C1、7H8、3C10、6C4、10G9、2C10和483。7株杂交瘤细胞诱导小鼠产生的腹水抗体效价分别为1：3200、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：6400和1：12800。9C1、7H8、3C10、6C4、10G9和2C10免疫球蛋白类型均为IgM,轻链均为K链;483免疫球蛋白类型为IgG2a,轻链为K链。Westernblot试验结果显示,这7株单克隆抗体均能与天然的PEDVN蛋白发生反应。     

鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠.将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1:160 000～1:640 000.亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgGl),轻链均为K链.Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47 ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69 ku).采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位.间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色.这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础.