鸡β-防御素Gal-1 cDNA的克隆及序列分析

利用细胞总RNA提取试剂盒,从1月龄SPF鸡白细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-1)cDNA片段。PCR产物经凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接,转化感受态JM109细胞,在含X-gal、IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与质粒限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段ORF大小为198bp,用Blast程序进行检索比较表明该序列与Genbank中发表的鸡Gal-1 cDNA编码区序列同源性高达99.5%。该cDNA序列编码65个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由40个氨基酸残基组成。     

鸡IL-1β cDNA克隆和序列分析及原位杂交检测

根据国外报道的鸡 IL- 1β序列 ,设计引物 ,以提取的鸡外周血单个核细胞总 RNA为模板 ,RT- PCR扩增 IL- 1β c DNA全序列。将 RT-PCR产物与 p UC19载体相连 ,转化大肠杆菌 ,经 PCR、酶切分析及序列测定得知所克隆序列与报道序列同源性达 99%以上 ,证明所克隆基因为目的基因。用地高辛随机引物法标记 IL- 1βc DNA制备探针 ,原位杂交检测禽脑脊髓炎病鸡与正常鸡脑组织中 IL- 1β m RNA表达情况 ,结果表明脑炎病鸡脑中 IL - 1β m RNA表达水平高于正常鸡。     

梅花鹿IFN-β1基因的克隆与分子进化分析

根据GenBank中牛干扰素-β1(IFN-β1)基因序列(E00137),设计并合成了1对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-β1全基因,并克隆、测序。结果表明:梅花鹿IFN-β1基因全长561 bp,编码186个氨基酸,含有6个与二硫键形成有关的半胱氨酸,3个糖基化位点,成熟蛋白含有4个α螺旋,3个β折叠区,7个β转角。序列比较分析发现,梅花鹿IFN-β1基因序列与GenBank发表的23种IFN-β1基因核苷酸序列同源性为3.2%⁹1.1%,氨基酸序列同源性为21.9%91.1%,氨基酸序列同源性为21.9%⁷9.7%。梅花鹿与其他23种动物的IFN-β1基因序列分析和系统进化树分析表明,IFN-β1基因存在种属特异性。梅花鹿INF-β1基因的成功克隆,为进一步研究梅花鹿INF-β1基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

口蹄疫病毒受体牛源β1亚基基因的分子特征

从口蹄疫病毒试验感染康复牛肺组织中克隆了β1亚基基因,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行了比较分析.结果显示,牛β1亚基基因的编码区含有2 397个核苷酸,编码798个氨基酸,含有10个潜在的糖基化位点,其中信号肽由20个氨基酸组成,胞外域由708个氨基酸组成,跨膜区由29个氨基酸组成,胞浆域由41个氨基酸组成.与GenBank中的牛β1基因的同源性达99.5%,从起始密码子开始共有12个碱基发生了变化,引起第217、247、268、281、321、691、709位的氨基酸改变,分别由F、S、W、V、H、Y、V变为S、P、R、G、Y、C、G.牛β1基因与猪、猩猩、猫、犬、人、小鼠和鸡的β1基因核苷酸序列同源性分别为93.8%、89.3%、91.6%、90.2%、89.6%、85.4%、75.6%,推导氨基酸序列同源性分别为98.2%、93.7%、97.5%、96.7%、94.2%、93.2%、84.1%.牛与猪β1亚基同源性最高.     

猪IFN-α1和IFN-β1基因的克隆与序列分析

从猪的肝细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增IFN-α1和IFN-1β基因,分别克隆到PMD18-T载体上。测序结果表明,克隆的IFN-α1核苷酸序列与GenBank上登录的猪IFN-α1核苷酸同源性为100%,与鼠、犬、人和牛IFN-α1基因同源性为71.1%~81.4%。克隆的IFN-1β核苷酸序列与Gen-Bank上登录的猪IFN-β1核苷酸同源性为99.6%,推导的氨基酸同源性为99.5%;与人、牛和马IFN-β1基因同源性为76.9%~80.4%。     

仙居鸡抑制素/活化素β_A亚基成熟区的cDNA克隆及序列分析

本研究根据发表的来航鸡抑制素 /活化素βA 亚基序列设计引物 ,运用RT PCR技术从仙居鸡卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素 /活化素βA 亚基成熟区序列 ,并进行了克隆和测序。结果显示 ,所测鸡成熟βA 亚基是由 116个氨基酸 (aa)残基组成的蛋白质 ,共有 9个半胱氨酸残基 ,与发表的鸡及哺乳类相应序列对比 ,其核苷酸序列的同源性分别为 99.2 %和 81%～ 85 .2 % ,其预测氨基酸序列的同源性分别为 10 0 %和 96 .6 %～ 97.4 % ,且所测鸡 βA 亚基成熟区半胱氨酸残基的数目和位置与发表的鸡和哺乳类相同 ,说明该亚基的序列及结构在不同物种间具高度保守性 ,揭示其可能具重要的生理功能     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

重组鸡β-防御素6基因的表达和生物学特性的研究

从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过RT-PCR扩增出鸡β-防御素-6(AvBD6)基因.经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为204 bp,编码68个氨基酸残基.根据已发现的禽β-防御素和鼠β-防御素-6的氨基酸序列构建系统进化树.发现鸡AvBD6氨基酸序列与鸡AvBD7氨基酸序列同源性最高,为62.7%.将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,进行原核表达.SDS-PAGE电泳表明,表达的重组鸡AvBD6融合蛋白分子量约为32 ku.对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定.结果表明,重组鸡AvBD6融合蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌的抗菌活性较弱,对猪霍乱沙门氏菌无抗菌活性.重组鸡AvBD6蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度范围为31.25μg/mL～250 μg/mL.此外,重组鸡AvBD6蛋白对温度和酸碱度有较高的稳定性.     

禽流感病毒A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株NP及M1基因的克隆及序列分析

参照已发表的A型禽流感核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)基因序列及其基因组特性,设计合成了一条通用反转录引物和两对特异性引物,采用RT-PCR法,成功克隆了禽流感病毒国内分离株A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株的NP、M1基因.序列测定结果为NP基因cDNA全长1497bp,编码498个氨基酸.M1基因cDNA全长759bp,编码252个氨基酸.将其序列与数株A型流感病毒(H9N2)NP及M1基因序列进行比较,NP基因同源性为90.51%～98.46%,氨基酸序列同源性为95.38%～98.59%.M1基因同源性为90.78%～97.36%,氨基酸序列同源性为95.63%～99.60%.     

北京鸭β-catenin基因cDNA的克隆和生物信息学分析

试验探讨了北京鸭β-catenin基因的生物学功能,为进一步研究该基因对鸭皮肤毛囊的影响奠定基础。以北京鸭胚胎皮肤组织为材料,根据GenBank中发表的鸡、鹅等物种的β-catenin基因序列,设计并合成4对引物,采用RT-PCR方法,克隆北京鸭β-catenincDNA,并运用DNAMAN软件及在线工具对所得到的序列进行生物信息学分析。结果表明:北京鸭β-catenin基因cDNA长度为2996bp(Genbank登录号为FJ169885),包含由2346个碱基组成的编码区(CDs),有起始密码子ATG和终止密码子TAA,编码781个氨基酸;北京鸭β-catenin基因核苷酸序列与鸡、鹅、中华鳖、人和家猪相应区段(CDs)的同源性分别为95.06%、94.12%、90.11%、84.83%、84.31%;其氨基酸序列与鸡、鹅、中华鳖、猪、人的氨基酸同源性达99%以上,表明在进化关系上,β-catenin氨基酸序列有很高的保守性。     

绵羊DECR1基因exon 5部分序列多态性分析

试验根据GenBank登录的牛2,4-双烯-CoA还原酶1(2,4-dienoyl-CoA reductasel,DECR1)基因序列(NP_001068891)设计引物,应用PCR技术对德国美利奴绵羊、杜泊绵羊、特克塞尔绵羊DECR1基因的exon 5部分序列进行克隆测序;利用PCR-SSCP技术检测了3个绵羊群体exon 5单链构象多态性(SNP),所获序列与GenBank中其他物种exon 5序列进行了同源性比较,并构建了亲缘关系聚类分析图.结果表明,绵羊DECR1基因exon 5长为137 bp,3个绵羊群体中exon 5均不存在SNPs,各种动物之间DECR1基因exon 5的同源性较高,在81.02%(鸡)～97.08%(牛)之间,其中绵羊和牛同源性最高,达到97.08%;与鸡的同源性最低,为81.02%;聚类分析结果显示,绵羊首先与牛聚为一类,再分别与兔子、狗聚为一类,最后分别与人、猪聚为一类,绵羊与牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远,与传统分类相一致,说明DECR1基因exon 5在动物进化过程中高度保守.     

鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒(DHV)浙江分离株Z10的全基因(5',3'末端序列用RACE法扩增)及4株DHV分离株的VP1基因.结果表明,分离株Z10的全基因片段长7689 bp,有1个大的开放读码框(ORF),ORF位于626～7326位核苷酸,编码2249个氨基酸.Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%～98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHv-Ⅰ VP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸.4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%～99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%～100%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群.     

鸡α干扰素基因的克隆和鉴定

采用反转录-聚合酶链反应技术，从传染性囊病病毒感染的鸡胚成纤维细胞中扩增出石岐杂鸡的α干扰素（spzChIFN-α)基因，将包括sqzChIFN-α编码区的cDNA片断克隆到pBssK载体中，并对该片断进行序列测定，核苷酸序列测定结果表明克隆的ChIFN-α基因cDNA片段长度为724bp，和其他ChIFN-α基因的同源性在9左.1%以上，与其它α食干扰素基因的同源性在67.4%以上，其中与鸭α干扰素基因的同源性为67.4%，与火鸡α干扰素基因的同源性为89.8%，推导的石岐杂鸡α干扰素氨基酸序列与其它禽类的α干扰素的同源性在49.2%以上，其中与白来航鸡α干扰素的同源性为96.9%-99%，与鸭和火鸡α干扰素同源性分别为49.2%和80.7%。     

仙居鸡抑制素/活化素βB亚基成熟区cDNA的克隆及序列分析

根据发表的哺乳类抑制素 /活化素 βB亚基 c DNA序列设计引物 ,运用 RT- PCR技术从仙居鸡卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素 /活化素βB亚基成熟区序列 ,并进行了克隆和测序。结果显示 ,鸡成熟βB亚基是由 115个氨基酸(aa)残基组成的蛋白质 ,具有 9个半胱氨酸残基 ,与发表的哺乳类相应序列对比 ,其核苷酸序列的同源性为 79.7%～82 .9%,其编码氨基酸序列的同源性为 95 .7%～ 98.3%。 βB亚基成熟区半胱氨酸残基的数目和位置与发表的哺乳类相同。说明该亚基的序列及结构在不同物种间具高度保守性 ,提示抑制素 /活化素 βB亚基可能具重要的生理功能。     

鸡艾美耳球虫3-1E基因的克隆与表达

应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)技术 ,分别从柔嫩艾美耳球虫甘肃株 (E.tenella GS,Et GS)和堆型艾美耳球虫青海株 (E.acervulina QH,Ea QH)孢子化卵囊子孢子中提取的总 RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原 3- 1E基因 (Et GS3-1E和 Ea QH 3- 1E)。将 Et GS3- 1E与原核表达载体 p GEX- 6 P1连接 ,构建了的 p GEX- 3- 1E原核表达质粒 ,并获得融合蛋白的高效表达和纯化。序列分析表明 :Et GS3- 1E和 Ea QH 3- 1E的 ORF均为 5 13个碱基 ,共编码 171个氨基酸。Et GS3- 1E的蛋白分子量为 18.5 k D,Ea QH 3- 1E的蛋白分子量为 18.6 k D。ORF比较 ,Et GS3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 2个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.8%,有 1个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 99.4 %;Ea QH 3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 4个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 97.7%,有 3个氨基酸变异 ,氨基酸同源性为 98.3%;Et GS 3- 1E与 Ea QH 3- 1E比较 ,有 3个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.2 %,有 2个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 98.8%。获得了 Et GS 3- 1E融合蛋白的高效表达和纯化 ,表达率达 4 3.2 %。     

传染性支气管炎病毒的分离及其S1基因高变区Ⅰ的遗传变异性分析

应用鸡胚尿囊腔接种的方法,从广西某一鸡场两群分别为48日龄和7日龄疑患传染性支气管炎的鸡中分离到两株传染性支气管炎病毒(IBV)(分别命名为GX-NN1和GX-NN2);利用反转录-聚合酶链式反应技术对分离株S1基因高变区Ⅰ(HVRⅠ)进行扩增并测定其核苷酸序列,以分析分离株遗传变异的情况。结果表明,两个分离毒株HVRⅠ核苷酸之间的同源性仅为76.3%,分离毒株与参考毒株的同源性在69.3%～99.1%之间;其中分离株GX-NN2与疫苗株H120、H52、Ma5、D41和标准株M41、Beaudette的同源性比较高(95.6%～99.1%),同属一个分支;而分离株GX-NN1则与这些参考毒株的同源性比较低(74.6%～75.4%),独自成为另一个分支。本研究的结果提示,广西养鸡业现场流行的IBV毒株已经发生了变异。     

鸡β-防御素Gallinacin-8基因片段的克隆与序列分析

本试验从鸡的肝脏中提取总RNA,根据GenBank公布的鸡β-防御素Gallinacin-8(简称gal-8)基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术扩增出大小为20lbp的鸡β-防御素gal-8的基因片段.通过序列分析得知其由66个氨基酸组成,包括20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片肽及41个氨基酸的成熟肽.BLAST分析表明与GenBank中已公布的序列相比较缺失2个碱基,其同源性达到98%.将该基因克隆进pGEM-T Easy载体中,并转化大肠杆茵感受态DH5α,经筛选和测序鉴定获得了阳性重组质粒.从重组质粒中扩增出的成熟肽,大小约123 bp.试验为进一步构建重组核蛋白及表达具有广谱抗微生物活性的防御素提供了实验基础.     

鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡胚IFN-y基因转录及cDNA克隆的研究

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从鸡新城疫系Ⅰ系疫苗接种的洛阳土种鸡胚脾提取的RNA中扩增到干扰素-γ(IFN-γ)基因cDNA。结果表明，以1：50或1：100稀释度接种后第48h提取的mRNA扩增效果最佳。序列测定显示，所克隆的洛阳土种鸡IFN-γ基因cDNA与所报道的鸡IFN-γ基因cDNA同源性为99．7％，相应的氨基酸序列同源性为100％，说明鸡IFN-γ基因编码区高度保守。     

鹅卵泡选择过程中差异表达基因的初步探索

采用银染mRNA差异显示技术筛选并克隆鹅卵泡选择过程中差异表达的基因片段,测序后在Genbank中进行Blast检索分析其同源性.共获得5个差异片段(EST,表达序列标签),经Blast同源性分析发现1个与人甲硫氨酸腺苷基转移酶Ⅱβ亚基(MAT Ⅱβ)同源,同源性为95%,另一个与鸡mKIAA0840基因同源,同源性为94%,其余3个与已知基因或序列无任何同源性,可能是尚未发现的新基因.本研究结果显示鹅卵泡选择过程中的基因表达存在差异,筛选出的5个EST的全序列和功能有待于进一步深入研究.     

鸡形目黑素皮质素受体1基因多态性研究

为了对已知的鸡形目禽类黑素皮质素受体1(MC1R)基因进行生物信息学和分子进化分析,根据已发表的12种鸡形目物种MC1R基因序列(包括棕色来航鸡、红色原鸡、土佐本地鸡、日系乌骨鸡、白色来航鸡、日本鹌鹑、火鸡、蓝胸鹑、珠鸡、朝鲜鹌鹑、河北柴鸡和略阳乌鸡),利用多种生物学软件进行遗传多态性研究。结果显示:12种鸡形目物种MC1R基因编码区碱基序列同源性和氨基酸序列同源性均较高(分别为98.84%,98.91%),蛋白质二级结构相似度极高,以α构螺旋为主(57.32%⁶7.83%),无规则卷曲次之(25.80%67.83%),无规则卷曲次之(25.80%²9.62%),β-折叠最少(6.05%29.62%),β-折叠最少(6.05%¹5.61%)。红色原鸡、土佐本地鸡和棕色来航鸡的二级结构组成相同,其中红色原鸡和土佐本地鸡的碱基CDS序列完全相同。分子进化分析发现,12个鸡形目物种可以明显地分为A、B、C 3个类群,火鸡、珠鸡、鹌鹑、蓝胸鹑、棕色来航鸡、红色原鸡和土佐本地鸡聚为A群;河北柴鸡、朝鲜鹌鹑和日系乌骨鸡聚为B群;白色来航鸡和略阳乌鸡聚为C群。火鸡较其他鸡形目起源较早,棕色来航鸡,白色来航鸡和略阳乌鸡起源较迟。但聚类结果中白色来航鸡和棕色来航鸡却属于不同类群,这可能是由于MC1R基因参与家禽羽色的调控,而白色来航鸡和棕色来航鸡羽毛色素存在明显差异,从而造成了二者在鸡形目MC1R基因分子进化树中的遗传距离较远。